SN_T 3687-2013桃X病植原体检疫鉴定方法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3687—2013桃X病植原体检疫鉴定方法Detection and identification of peach X phytoplasma2013-08-30发布2014-03-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局壹真伤 SN/T3687—2013前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国湖北出人境检验检疫局、华中农业大学、中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局。本标准主要起草人：冯汉利、王利平、王振华、洪霓、李金甫、赵晖、曾宪东、王有福，I SN/T3687—2013桃X病植原体检疫鉴定方法1范围本标准规定了植物检疫中桃X病（Peach Xdisease)的现场检疫和分子生物学鉴定方法。本标准适用于进出境桃、油桃、樱桃、李树等种苗中桃X病植原体的检疫鉴定。2桃X病植原体基本信息英文名：PeachXphytoplasma分类地位：细菌界（Bacteria），软壁菌门（Teneericutes），柔膜菌纲（Mollicutes）（又称软球菌纲），非固醇菌原体目（Acholeplasmatales），非固醇菌原体科（Acholeplasmataceae），植原体属（phytoplasma），16SrII植原体组。该植原体的地理分布寄主范围和症状、传播途径及基因组特征等参见附录A。3方法原理DAPI染色后的形态学观察为初步筛查方法；以植原体核糖体16SrDNA通用引物进行PCR扩增、测序及限制性内切酶指纹图谱为主要的判定依据。4主要仪器设备和用具4.1仪器设备PCR仪、荧光显微镜、超净工作台、切片机、电泳仪、凝胶成像分析仪、冷冻离心机、电子天平（1/10000g）、超低温冰箱、常规冰箱、灭菌锅、pH计、水浴锅、振荡器等。4.2用具可调移液器（0μL～20μL、20μL~200uL、200μL～1000μL）、吸头、研钵、离心管（1.5mL、10mL）、PCR管（0.2mL）、量筒、烧杯、镊子等。5主要试剂5.1CTAB缓冲液2%CTABTris-HCl100 mmol/L(pH 8.0)EDTA20 mmol/L(pH 8.0)氯化钠(NaCI)1.4 mol/LPVP 401% SN/T3687—20135.2其他试剂DAPI染色液、液氮、MgCl2、dNTP、TaqDNA聚合酶、引物等。6检疫鉴定方法6.1症状检查观察桃、樱桃、油桃等种苗、果实、叶片等，症状描述参见附录A6.2样品的采集及制备取有疑似症状的植物的不同部位叶、枝等植物部分进行实验室检测鉴定。6.3DAPI染色选取幼嫩组织（叶脉、侧芽），将叶柄和叶脉固定于5%戊二醛缓冲液中，4℃保存备用。制作切片，切片经0.1mol/L，磷酸缓冲液（pH7.0）冲洗3次；用1μg/mLDAPI溶液染色10min～15min，在460nm激发条件，荧光显微镜观察，在韧皮部筛管部位有明显的蓝色荧光信号表明有植原体存在。6.4植原体形态观察对采集的植物样品制备超薄切片，通过透射电镜观察植原体形态方法（见附录B）。6.5植原体通用引物的Nested-PCR扩增、凝胶电泳及序列测定16SrDNA的扩增使用巢式PCR，第一次PCR扩增使用通用引物为P1/P7，第二次PCR扩增采用通用引物R16F2n/R2；基于引物R16F2n/R2扩增的16SrDNA基因的PCR产物凝胶电泳并经测序。具体操作见附录C。6.6通用引物扩增产物的RFLP指纹图谱检测在6.5检测中，若经通用引物R16F2n/R16R2扩增所得到的序列通过软件进行RFLP图谱分析，具体操作见附录D。7结果判定7.1症状表现与A.3描述一致且DAPI染色观察结果显示蓝色荧光，可初步判定为植原体，但需通过6.5、6.6的方案进一步检测。7.2在6.4检测中，电镜超薄切片在韧皮部筛管细胞中存在大量植原体，可初步判定该植物样品携带植原体，需要通过6.5、6.6的方案进一步检测。7.3在6.5检测中，若通过通用P1/P7及R16F2n/R2两对引物进行巢式PCR扩增，第二次扩增产物经凝胶电泳检测结果为阳性，且R16F2n/R2扩增产物测序结果经比对，与C.4序列一致，则可判定该样品携带桃X病植原体。7.4在6.6检测中，通用引物R16F2n/R2扩增产物的RFLP分析片段大小与桃X植原体标准图谱（见图D.1)相符，可判定该样品携带桃X病植原体。2 SN/T 3687-20138样品保存8.1样品保存与处理样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出桃X病植原体的样品应保存于一20℃冰箱中，以备复核。该类样品保存期满后须经高压灭菌后方可处理。8.2结果记录与资料保存完整的实验记录包括样品的来源、种类、