SN_T 1150-2015南芥菜花叶病毒检疫鉴定方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1150—2015代替SN/T1150——2002南芥菜花叶病毒检疫鉴定方法Detection and identification of Arabis mosaic virus2015-12-04发布2016-07-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1150—2015前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准代替SN/T1150—2002《南芥菜花叶病毒检疫鉴定方法》。与SN/T1150-2002相比，主要技术变化如下：增加了RT-PCR和实时荧光RT-PCR检测方法的内容。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准负责起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、中华人民共和国北京出入境检验检疫局本标准主要起草人：吴际云、陈枝楠、郑耘、张伟锋、卢小雨、冯建军、王红英、龙海、李芳荣、胡运发、邓琼、邓丛良。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：-SN/T1150—-2002。T SN/T 1150-2015南芥菜花叶病毒检疫鉴定方法1范围本标准规定了南芥菜花叶病毒的生物学测定、血清学检测、免疫电镜、RT-PCR检疫鉴定方法。本标准适用于进出境植物种子苗木等繁殖材料和植物产品中南芥莱花叶病毒的检疫鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T28073南芥菜花叶病毒检疫鉴定方法SN/T1840植物病毒免疫电镜检测方法SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样3基本信息学名：Arabis mosaic virus缩写：ArMV分类地位：豇豆花叶病毒科（Comouiridae），线虫传多面体病毒属（Nepovirus）。其他信息参见附录A。4原理和方法依据ArMV鉴别寄主的症状、病毒形态、免疫学特性及分子生物学特性进行检测判定。5仪器设备用具及设施5.1仪器设备天平（感量1/10000g）、pH计、酶标仪、透射电子显微镜、PCR仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、恒温水浴锅、离心机、超低温冰箱等。5.2用具微量移液器、研钵、离心管、花盆、消毒土等。5.3设施植物隔离检疫温室。6试剂DAS-ELISA检测试剂（见附录B）、RT-PCR检测试剂（见附录C）、生物学测定试剂（见8.5）。免疫1 SN/T 1150—2015电镜检测试剂按照SN/T1840的规定执行，实时荧光RT-PCR检测试剂按照GB/T28073的规定执行。7样品制备7.1种子类抽样按照SN/T2122的规定执行。将种子（重点挑取畸形、不成熟的种子)播于灭菌土中，于25℃左右生长并进行症状观察。待长出3片～4片叶后将表现症状的植株编号，未表现症状的植株分组（10株为1组)并编号。7.2苗木类抽样按照SN/T2122的规定执行。将苗木种植于隔离温室中，于25℃左右生长并进行症状观察。有症状的苗木单独检测。没有症状的分组检测，分组方法同7.1。8检测方法8.1DAS-ELISA 检测方法见附录B。8.2免疫电镜检测按照SN/T1840.的规定执行。8.3RT-PCR检测方法见附录C。8.4实时荧光RT-PCR检测按照GB/T28073的规定执行。8.5生物学测定8.5.1接种病叶加1：1（质量：体积）的磷酸盐缓冲液（0.1mol/L，pH7.2）于研钵中充分研碎，在待接种植物叶片表面均匀洒上硅藻土，用手指蘸取研磨好的汁液轻轻涂抹于叶片表面。8.5.2鉴别寄主症状对经DAS-ELISA检测出的阳性样品植株，采其叶片，加入适量样品提取缓冲液研磨后的汁液，在室温（20℃25℃）条件下，用摩擦接种法接种栽种于检疫隔离温、网室中的昆诺藜或苋色藜、黄瓜、“Prince菜豆、矮牵牛和番杏等鉴别寄主植物。昆诺藜（Chenopodium quinoa）或苋色藜（C.amaranticolor）：接种后4d～6d接种叶出现局部褪绿斑，然后出现系统褪绿斑驳。黄瓜（Cucumis satiuus）：接种子叶5d～7d后出现局部褪绿斑或小型坏死环斑或黄斑，后出现系统环线脉，畸形。2 SN/T 1150—2015“Prince菜豆（Phaseolus vulgaris cv.Prince）：接种5d～7d后表现为局部褪绿、坏死或畸形。矮牵牛（Petunia hybrida）：接种叶出现局部枯斑或坏死环斑，接着表现系统褪绿环斑或线纹或明脉。番杏（Tetragonia eapensa）：接种3d～7d后接种叶出现细轮纹，后表现环斑。9结果判定DAS-ELISA检测为阳性后,RT-PCR或免疫电镜检测结果为阳性可判定检出黄瓜花叶病毒。如果上