SNT 2343-2009菜豆荚斑驳病毒检疫鉴定方法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2343--2009菜豆荚斑驳病毒检疫鉴定方法Quarantine identification of bean pod mottle virus2009-07-07发布2010-01-16实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局好码防伪 SN/T 2343--2009前言本标准的附录 B、附录 C、附录 D为规范性附录,附录 A 为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国厦门出人境检验检疫局、中华人民共和国福建出人境检验检疫局、中华人民共和国深圳出人境检验检疫局。本标准主要起草人：廖富荣、陈青、沈建国、郑耘、林石明、陈红运、郭琼霞、黄蓬英、王宏毅、吴媛、游源浅、虞赞。本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 SN/T 2343—2009各种吸头(1000 μL、200 μL、20 μL、2 μL);-96孔酶标板；离心管(1.5 mL、0.6 mL、0.2 mL)。3.2主要试剂主要试剂和缓冲液见附录 B和附录 C。4检测样品的制备4.1检测样品将送检样品制备为血清学或分子生物学检测鉴定的检测分样品。对每批送检样品进行症状检查，挑选具有褐色或黑色斑驳症状的种子(从种脐开始），或者选取县有斑驳、皱缩、褪绿等症状的叶片。4.2DAS-ELISA和 IC-RT-PCR检测样品的制备种子样品：选取一定量的种皮作为检测分样品（如0.5g～1.0g)，在液氮中充分研磨，回温后按比例加入样品提取缓冲液继续研磨汇通常_1：（5～10)】。叶片样品：选取一定量的叶片作为检测分样品（如0.5g～1.0g），在液氮中充分研磨，回温后按比例加人样品提取缓冲液继续研磨（通常1：10)。把研磨后的样品转移到5mL离心管中，8000 r/min离心5min，上清液作为 DAS-ELISA 和IC-RT-PCR检测提取液。注：提取液在3h内使用,否则保存在.4℃中。4.3RT-PCR检测样品的制备称取表现症状的0.1g叶片种子等样品在液氮中充分研磨后，提取RNA。5 检测与鉴定5.1 DAS-ELISA 检测DAS-ELISA检测应设置对照，用健康的植物组织作阴性对照，用感染BPMV 的植物组织作阳性对照，用样品提取缓冲液作空白对照。其中，阴性对照的种类和材料(如种子或叶片)应该尽量与所检测样品相一致。当使用商业性检测试剂盒时，参照试剂盒说明进行操作。具体操作过程见附录 B。5.2 RT-PCR 检测RT-PCR检测应设置对照用健康的植物组织作阴性树照，用感染BPMV 的植物组织作阳性对照，用ddH2O作空白对照。具体操作过程见附录 C。5. 3 IC-RT-PCR 检测IC-RT-PCR检测应设置对照，用健康的植物组织作阴性对照，用感染 BPMV 的植物组织作阳性对照,用 ddH2O作空白对照。具体操作过程见附录D。5.4序列测定将 PCR产物回收后，进行克隆、测序,或者直接测序，测序可由生物公司完成。把测序所得到的核苷酸序列与已知的 BPMV 相应序列进行比对,如果与已知的 BPMV 相应序列相一致则判定为 BPMV,不一致则判定为非 BPMV。6结果判定与记录6.1 结果判定当DAS-ELISA检测结果呈阳性、同时 IC-RT-PCR 或 RT-PCR检测结果呈阳性时,则判定为检出 BPMV;2 SN/T 2343—2009-当 IC-RT-PCR 或RT-PCR 检测结果呈阳性、同时序列测定结果为 BPMV序列时，则判定为检出 BPMV。6.2结果记录记录各项实验数据，包括样品种类、来源，检测时间、地点、方法和结果等。血清学检测结果保留吸光值的数据报告，分子生物学检测结果保留电泳照片，序列测定结果保留测序报告图。样品的保存7经检测携带BPMV的样品保存在一80℃超低温冰箱中，并作好登记和标记工作。3 SN/T 2343—2009B.2.3加入酶标抗体根据试剂盒说明，用酶标抗体缓冲液稀释相应的酶标抗体（如1：200）。倒去孔中的检测样品提取液,用PBST洗4次～5次孔（可在洗板机上完成）。每孔加入100 μL酶标抗体溶液。在室温下孵育 2 h。B.2.4.加底物用底物缓冲液配制 1 mg/mL的底物溶液。倒去酶标抗体溶液，用 PBST洗4次～5次孔（可在洗板机上完成）。每孔加人100 μL新鲜配制的底物溶液。室温下避光放置（约30min～60min），至阳性对照孔明显显色。注：在准备底物溶液的过程中,不要接触药剂或暴露在强光中，以避免在阴性对照孔中出现背景颜色。B.2.5吸光值的测定用酶标仪在 405 nm处读取吸光值。B.3 结果判定B.3.1对照孔的OD405值(缓冲液孔、阴性对照及附性对照孔）,应该在质量控制范围内，即：缓冲液孔和阴性对照孔的O