SN_T 3437-2012马铃薯纺锤块茎类病毒检疫鉴定方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3437-2012马铃薯纺锤块茎类病毒检疫鉴定方法Detection and identification of potato spindle tuber viroid2012-12-12 发布2013-07-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局0：证真伪 SN/T 3437—2012前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国黑龙江出入境检验检疫局、中华人民共和国厦门出人境检验检疫局、中华人民共和国湖北出入境检验检疫局、黑龙江省农业科学院植物脱毒苗木研究所。本标准主要起草人：刘洪义、刘忠梅、陈红运、吕典秋、邱彩玲、张洪祥、王振华、杨立群、刘尚武、一 SN/T3437—2012马铃薯纺锤块茎类病毒检疫鉴定方法1范围本标准规定了马铃薯纺锤块茎类病毒（potatospindletuberviroid)的检疫鉴定方法，本标准适用于检测可能带有马铃薯纺锤块茎类病毒的马铃薯脱毒苗、试管苗、种薯、商品薯、大田中生长的马铃薯及收获后的块茎、番茄、鳄梨、人参果等其他寄主2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样o3原理3.1马铃薯纺锤块茎类病毒基本信息种名：potatospindletuberviroid缩写：PSTVd异名:potato spindle tuber virus,potatolgothic virus,tomato bunchy top virus。分类：马铃薯纺锤块茎类病毒科（familypospiviroidaé），马铃薯纺锤块茎类病毒属（GenusPospivir-oid)。马铃薯纺锤块茎类病毒的其他信息参见附录A。3.2检疫鉴定依据PSTVd的基因组特征和在寄主植物土的症状特征是检疫鉴定的依据。PSTVd是一种具有侵染性、无外壳蛋白、高度碱基配对的棒状共价闭合环状单链小的RNA分子。PSTVd的RNA变性后转变为开环状分子，这种环状的RNA分子在聚丙烯酰胺凝胶电泳中迁移率比相同相对分子质量的线状分子要慢得多。依据基因组特征建立往返聚丙烯酰胺凝胶电泳（Return-PolyacrylamideGelElectrophoresis，R）、RT-PCR、实时荧光RT-PCR(Real-timePCR)检测方法，这些方法结合寄主植物症状的有无和症状特征（参见附录A），判断样品是否带有PSTVd。4仪器设备、用具及试剂4.1仪器设备PCR仪、实时荧光PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、垂直电泳槽、小型离心机、台式冷冻离心机、水浴锅、凝胶成像系统、制冰机、冷藏冷冻冰箱、电子天平、涡旋振荡器、烘箱等。1 SN/T3437—20124.2用具可调移液器（0.1μ~2.5μ，2μ～20μ，10μ～100μ20μ～200μ，100μl～1000μl）和可调移液器头、离心管、研钵、微型磨杆。4.3试剂主要试剂见附录B、附录C、附录D。5检疫鉴定5.1检测方法的选择及检测鉴定的流程本标准采用RT-PCR、实时荧光RT-PCR（Real-timePCR）、往返聚丙烯酰胺凝胶电泳（Return-PolyacrylamideGelElectrophoresis，R)检测方法。检测流程见图1、图2。进口脱彝苗、试管苗进口种薯、商品薯隔离种植，症状检查初级检测(R、RT-PCR或Real-timePCR)有症状初级检测给(R、RT-PCR或Real-time PCR)生梨无症状有症PSTVd阴性无状技型症有症状状无症状有症状无症状PSTVd阴性二级检测试验方法(R、RT-PCR或Real-timePCR)样品带有法指PSTVd图1进口马铃薯种薯、商品薯、脱毒苗和试管苗系统检测确认PSTVd存在与否的判定方案2 SN/T 3437—-2012大田植株、收获后的块茎初级检测(R、RT-PCR或Real-timePCR)性终果结果有症状有症状无症状无症状二级检测试验方法PSTVd阳性PSTVd阴性(R、RT-PCR或Real-time PCR)结巢样品带有PSTVd图2收获后的块茎或收获前大田植株系统检测确认PSTVd存在与否的判定方案5.2隔离种植及症状检查所有进境的脱毒苗、种苗等各类可繁殖的马铃薯材料都需要按有关要求隔离种植，生长温度应至少高于18℃（更适宜的温度是高于20℃）和至少16h的光周期。在生长期间进行严格的症状检查。仔细检查马铃薯植株是否有可疑症状，在花期或接近花期时，采集有可疑症状的植株