WS_T 633-2018巴贝虫检测 虫种核酸鉴定法.pdf

ICS 11. 020C 61Ws中华人民共和国卫生行业标准WS/T 633—2018巴贝虫检测虫种核酸鉴定法Detection of Babesia spp.-Identification of species by nucleic acid method2018 - 09 - 26 发布2019-04-01实施中华人民共和国国家卫生健康委员会 发布 WS/T 633—2018前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家卫生标准委员会寄生虫病标准专业委员会提出。本标准起草单位：中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所、复复旦大学、第二军医大学。本标准起草人：刘琴、周晓农、张仪、胡薇、陈家旭、朱淮民。I WS/T633—2018巴贝虫检测虫种核酸鉴定法1范围本标准规定了检测巴贝虫的虫种核酸鉴定法。本标准适用于各级疾病预防控制机构和医疗机构对巴贝虫的检测。2规范性引用文件1下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。WS/T564巴贝虫病诊断3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3. 1巴贝虫Babesiaspp.类寄生于人和脊椎动物红细胞内的原虫，可引起巴贝虫病（babesiosis）。感染人体的巴贝虫种类主要有田鼠巴贝虫（Babesiamicroti)、分歧巴贝虫（B.divergens）、邓肯巴贝虫（B.duncani）和猎户巴贝虫（B.venatorum）等（参见附录A）。仪器和器材44.1高速离心机最大相对离心力为12000xg。4.2涡旋仪无级调速范围为200r/min~3000r/min。4.3PCR扩增仪温度范围为4℃～99℃，温度精确为0.1℃，热盖为105℃。4.4微波炉4.5电泳仪电压为5V~5000V，电流为1mA～500mA。1 WS/T 633—20184.6凝胶成像系统镜头分辨率(H×V)为1360×1024，光源为透射UV。5试剂和材料55.1分子生物学试剂Taq酶、脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）、分子质量指示物及核酸提取试剂盒选用商品化产品。5. 2化学试剂Tris-乙酸电泳缓冲液（TAE）、琼脂糖凝胶、6×加样缓冲液（参见附录B）。5.3引物扩增巴贝虫18S核糖体RNA（18SrRNA）基因和转录间隔区（ITS）基因的特异性引物（见附录C)。5.4参照材料阳性对照为田鼠巴贝虫peabodymjr株基因组DNA。空白对照为去离子灭菌水。阴性对照为健康人全血基因组DNA。6检测步骤6.1样品样品为临床诊断或疑似巴贝虫病病例抗凝血样品。6. 22虫种核酸鉴定6.2.1核酸提取基因组DNA提取采用商品化全血DNA提取试剂盒（参见附录B）6.2.218SrRNA基因扩增见附录C。6.2.3ITS基因扩增见附录 C。6.2.4结果判定电泳分析.1电泳2 WS/T633—2018取第二轮PCR产物5μL与1μL6×加样缓冲液混合，加样于含溴化乙锭替代物的1.0%琼脂糖凝胶中，在1×TAE缓冲液中，5V/cm电泳约40min，当溴酚蓝到达底部时停止电泳，用凝胶成像系统或紫外分析仪分析。.2PCR结果判断.2.1PCR扩增巴贝虫18SrRNA基因，出现大小为400bp左右特异性的扩增片段，空白对照和阴性对照未出现条带，PCR结果阳性。PCR扩增巴贝虫18SrRNA基因，未出现大小为400bp左右特异性的扩增片段，空白对照和阴性对照未出现条带，PCR结果阴性。.2.2PCR扩增巴贝虫ITS基因，出现大小在700bp2100bp的特异性的扩增片段，空白对照和阴性对照未出现条带，PCR结果阳性。PCR扩增巴贝虫ITS基因，未出现特异性的扩增片段，空白对照和阴性对照未出现条带，PCR结果阴性。测序分析阳性PCR扩增产物进行双向测序，将序列进行BLAST比对分析（见附录C）。虫种鉴定根据PCR扩增产物电泳结果与测序结果分析，综合判定虫种种类（见附录C）。3 WS/T 633—2018附录A（资料性附录）病原生物学A.1分类巴贝虫（Babesiaspp.）属于顶复门（Apicomplexa）、孢子虫纲（Sporozoa）、梨形虫亚纲（Piroplasmasina）、梨形虫目（Piroplasmida）、巴贝虫科（Babesidae）的巴贝虫属（Babesia）。目前已鉴定的有100多种巴贝虫，可以感染牛、马、羊、犬等多种哺乳动物和鸟类。在100多种巴贝虫中，既往已知可以感染人的巴贝虫种类主要有：田鼠巴贝虫(B.microti)、分歧巴贝虫（B.divergens）、邓肯巴贝虫（B.duncani，也称为WA1）和猎户巴贝虫（B.venatorum，也被称为EU1）等。不同巴贝虫虫种引起人