SNT 2428-2010犬瘟热诊断方法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2428—2010犬瘟热诊断方法Diagnostic techniques for canine distemper2010-07-16实施2010-01-10 发布中华人民共和国发布(线录量拨款19015查试真5国家质量监督检验检疫总局数码防伪 SN/T 2428—2010前言本标准的附录 C为规范性附录,附录 A、附录 B为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国黑龙江出人境检验检疫局、中华人民共和国山东出人境检验检疫局。本标准主要起草人：张子群、谢晓峰、岳志芹、何浩、徐义刚、李维刚、由轩、金宁。本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 SN/T 2428--2010犬瘟热诊断方法1范围本标准规定了犬瘟热(Canine Distemper,CD)的检疫技术规范,包括犬瘟热病毒(CDV)的分离与鉴定、间接免疫荧光技术、免疫酶试验、免疫酶组织化学试验。本标准适用于犬瘟热的检疫。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的必威体育精装版版本。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3概述犬瘟热(CD)相关资料参见附录 A。CD 的诊断可以通过流行病学、临床症状、病理剖检变化对犬瘟热作出初步诊断,对 CD 作出确诊可进行病毒分离鉴定、间接免疫荧光技术、免疫酶试验、免疫酶组织化学试验等实验室诊断。临床诊断4根据临床症状和病理学检查,参见附录 B,可做初步诊断依据。5 实验室诊断技术5. 1 病毒分离与鉴定5.1.1材料准备实验材料和试剂.1Vero 细胞(非洲绿猴肾细胞）、MDCK 细胞(犬肾传代细胞）。.2溶液配制:包括细胞培养液、细胞维持液、细胞分散液、PBS等。配方及配置方法见附录C。实验用水应符合GB/T6682要求。设备和器材5. 1. 1. 2. 1细胞培养瓶、细胞培养板。5. 1. 1.2.2吸管。.3二氧化碳培养箱。5. 1. 1. 2. 4‘37℃恒温水浴箱。5.1. 1.2.5普通冰箱和低温冰箱。5. 1. 1.2. 6离心机及离心管。研磨器械。.75. 1. 1. 2. 8普通光学显微镜和倒置显微镜。微量加样器,容量 5μL～50μL,50 μL～200 μL。5. 1. 1.2.9 SN/T 2428—20.100.45 μm微孔滤器。组织悬液的制备CDV存在于病犬心脏、肺脏、脾脏、胸腺、淋巴结等组织器官中。无菌采集这些器官用加双抗（含青霉素2000 IU/mL、链霉素2000 μg/mL)的细胞维持液，制成20%组织悬液，4℃浸泡4 h,然后反复冻融3次,3 000 r/min 离心30 min，取上清液，一20 ℃冷冻保存，备用。试验前，10 000 r/min 离心20 min,取上清液，用于CDV分离。5.1.2　操作方法细胞分离法用常规方法培养细胞单层,待长至80%左右时，用于 CDV分离。吸去培养液，用无血清培养液洗涤 1次。如用细胞培养瓶，按 1 mI/25cmr²接种处理好的组织清液，每样接种两瓶；如用细胞培养板，则按每孔0.1mL接种处理好的组织上清液，每样接种2孔。33℃吸附1h，弃去上清液，加入细胞维持液,置 37℃ 5%二氧化碳培养箱内培养,24 h 后逐日观察细胞病变,连续观察5 d～7d。结果观察CDV感染Vero 细胞3d～4 d 后、MDCK 细胞2d 后,出现,CPE 变化,细胞变圆,胞浆内颗粒变性和空泡形成,随后形成巨细胞和合胞体,并在胞浆内出现包涵体。若第一次接种后未出现细胞病变，应将细胞培养物冻融后盲传三代，进行观察。如仍无细胞病变,则判为 CDV 检测阴性。CDV 的鉴定将出现细胞病变的细胞培养物，按5.2进行鉴定；或按5.3的方法制备细胞涂片，用CDV单克隆抗体进行鉴定。5.2间接免疫荧光技术5.2.1材料准备 试剂.1磷酸盐缓冲液(PBS):配制见附录 C.2CDV单克隆抗体：使用前稀释成适当的工作浓度。.3FITC荧光素标记羊抗鼠IgG抗体使用前用0.02%伊文斯蓝稀释至工作浓度。.4碳酸盐缓冲甘油：配制见附录C。器材.1荧光显微镜。.2可调微量加样器(5 μl～50 μL,50 μL~200 μl,100 μL～1 000 μL)。.337℃恒温水浴箱。.4载玻片和盖玻片。样品.1细胞培养物：按5.1用24孔细胞培养板进行病毒分离培养，出现细胞病变的培养孔，吸去细胞维持液，用PBS漂洗，自然干燥。.2血液涂片：无菌采取待检犬静脉末端血,直接涂片，室温条件下自