SN 1418-2004鸭病毒性肝炎Ⅰ型病毒血清中和试验.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1418—2004鸭病毒性肝炎I型病毒血清中和试验Serum neutralization test for duck virus hepatitis type I virus2004-06-01发布2004-12-01 实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局数码防伪 SN/T 1418—2004前言本标准的附录 A为规范性附录，附录B为资料性附录。本标推由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国珠海出人境检验检疫局。本标准主要起草人：陈琨、黄新民、徐海聂、杨素、潘文波、廖秀云。本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 SN/T 1418--2004鸭病毒性肝炎I型病毒血清中和试验1范围本标准规定了鸭病毒性肝炎I型病毒血清中和试验操作方法。本标准适用于检测血清中的鸭病毒性肝炎 1 型病毒抗体。主要用于鸭病毒性肝炎的诊断及病原鉴定、免疫水平的监测和流行病学调查。2缩略语下列缩略语适用于本标准。2. 1BME:Eagles Basal Medium 细胞基础盐培养基。2.2CPE:细胞病变。2.3DEK:鸭胚肾细胞。2. 4DEL:鸭胚肝细胞。2.5DHV-I:鸭病毒性肝炎I型病毒。2.6FCS:胎牛血清。2.7MEM;Eagles Minimal Essential Medium 细胞培养基。2.8PFU:空斑形成单位。2. 9TCIDsa:半数细胞培养感染量。3原理病毒感染敏感的细胞单层后，可以在细胞单层上生长增殖，并能产生 CPE,使感染细胞圆缩、坏死并形成空斑，血清中的特异性抗体能够抑制病毒在细胞单层上生长，血清抗体中和病毒的能力可以通过其阻止 CPE产生的程度加以测定。本中和试验是应用固定病毒量稀释血清的方法,在 DEL 或 DEK 细胞单层上进行中和试验，用于鸭血清抗体的测定或病原的鉴定。仪器设备44.1高压蒸气灭菌器。4.2可调移液器。4.3二氧化碳恒温培养箱。4.4倒置显微镜。4.5除菌过滤器。 SN/T 1418—20045材料准备5.1 鸭病毒性肝炎I 型病毒。5.2抗鸭病毒性肝炎I 型病毒的阴、阳性血清,使用前均以 56℃灭能 30 min 后备用。5.3受检血清按常规方法采血并分离血清,使用前均以 56℃灭能 30 min后备用。5.4溶液的配制：见附录A。5.5细胞培养板：选用无菌的孔径为5cm平底带盖塑料培养皿，或96孔平底带盖塑料培养板。5.6其他仪器：如剪刀、镊子、平血、烧杯、三角瓶、刻度离心管、注射器、吸头等以 112 kPa 高压灭菌30 min，烘干后备用。5.7 DEL细胞单层的准备:参见第 B.1章。5.8 DEK 细胞悬液的准备:参见第 B.2 章。 6血清中和空斑减数试验6.1病毒毒价测定及配备取 DHV-I用维持液将病毒液作10 倍系列稀释,每个稀释度接种三个培养Ⅲ,按 7.2.4 和 7.2.5的方法进行试验。取每个稀释度的三个培养血的空斑平均数,用 Reed-Muench 法计算病毒的 PFU 量，使用前配制成含200PFU/0.1mL的病毒悬液备用。6.2操作步骤6.2.1血清稀释及中和感作：分别取阳性血清、阴性血清、受检血清样品，用维持液作两倍系列稀释，每个稀释度加入等量病毒悬液，然后置37℃中和感作60 min，每个稀释度接种三个培养血。6.2.2细胞对照:设三个培养Ⅲ的正常细胞对照,加人维持液。6.2.3病毒对照:设三个培养血的病毒对照,将上述使用的病毒悬液稀释为 100 PFU/0.1 mL。6.2.4取已长满DEL细胞单层的细胞培养皿，吸去培养液，用维持液清洗两次，将上述稀释及感作好的混合液移人细胞培养Ⅲ内，每个培养血0.1mL,加盖后轻轻摇，使液体均匀分布于 DEL细胞单层表面，然后置室温（20℃～22℃)感作30min。6.2.5每培养血加人琼脂维持液3mL,加盖后，置37℃、3%～5%二氧化碳培养箱培养 48 h，取出后用偏光源(或低倍倒置显微镜)直接观察空斑的形成情况，或用10%的福尔马林固定后用1%的结晶紫染色观察空斑，并记录形成空斑的数量。6.3结果判定6.3.1当细胞对照正常，阳性血清效价与原滴定的效价相差1个滴度以内，病毒对照的三个培养皿的平均空斑数误差在10 PFU 以内时整个试验有效。6.3.2出现50%空斑减数的血清最高稀释倍数为该血清的抗体滴度。7 微量血清中和试验7.1病毒毒价(TCID5o）测定及配备取DHV-I细胞适应毒用稀释液将病毒液进行10倍系列稀释，加入96孔培养板内，每孔50uL，每个稀释度接种八个培养孔，然后每孔加人100μL的DEK细胞悬液，然后每孔补加稀释液50μL。加盖后，置 37℃、3%～5%二氧化碳培养箱培养96 h，取出观察并记录