NY_T 3195-2018热带作物种质资源抗病虫鉴定技术规程 橡胶树棒孢霉落叶病.pdf

ICS 65.020B 16NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 3195—2018热带作物种质资源抗病虫鉴定技术规程橡胶树棒孢霉落叶病Technical code of practice for resistance identification to diseases and insects oftropical crops germpalsm-Corynespora leaf fall disease of rubber tree2018-06-01实施2018-03-15发布中华人民共和国农业部-发布 NY/T 3195—2018前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由农业部农垦局提出。本标准由农业部热带作物及制品标准化技术委员会归口。本标准起草单位：中国热带农业科学院环境与植物保护研究所。本标准主要起草人：黄贵修、刘先宝、李博勋、时涛、李超萍、蔡吉苗、陈奕鹏、杨扬I NY/T 3195—2018热带作物种质资源抗病虫鉴定技术规程橡胶树棒抱霉落叶病1范围本标准规定了橡胶树[Heveabrasiliensis（Willd.exA.Juss.）Muell.Arg.棒孢霉落叶病抗病性评价的术语和定义、病原菌分离鉴定及接种体制备、抗病性鉴定、抗病性评价、抗病性评价有效性判定和结果记录。本标准适用于橡胶树棒抱霉落叶病抗病性品系筛选，2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。NY/T221/橡胶树栽培技术规程3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3. 1橡胶树棒孢霉落叶病corynespora leaf fall disease of rubber tree由多主棒孢病菌（CorynesporacassiicolaBer.Curt.）侵染引起的真菌病害，可造成橡胶树的反复落叶。橡胶树棒孢霉落叶病田间症状参见附录A的A.1。3. 2多主棒孢毒素cassicolintoxins一类由多主棒孢病菌产生的寄主专化性毒素（HST），是对寄主植物有选择性或专化性的多肽。3. 3萎蕉指数wiltindex(WI)通过对植物叶片水分损失数值的计算所获得的叶片萎程度的数值化描述。4病原菌分离鉴定及接种体制备4.1病原菌分离鉴定从发病植株上选取有典型病斑的叶片，用常规组织分离法分离棒孢霉落叶病病原菌，通过单孢分离法对分离物进行纯化，经致病性测定后，菌株通过形态学（参见A.2)和ITS系统发育学分析确定为多主棒孢菌，再用多主棒孢毒素的cas2亚型和cas5亚型特异引物检测确定菌株的毒素类型（参见附录B），分别选择cas2亚型和cas5亚型的强致病力菌株用灭菌的超纯水保存备用4.2病原菌菌饼接种体制备将保存的cas2亚型和cas5亚型多主棒孢病菌接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上（平板直径9cm），（28土1)℃恒温培养7d，用打孔器取菌落外缘的菌饼（直径5.0mm）作为接种体，对照则取同样大小的空白PDA培养基4.3多主棒孢粗毒素提取液制备4.3.1改良培养基改良Fries3号培养基：蔗糖20.0g，酒石酸铵5.0g，KHzPO+1.0g，NH.NO31.0g，MgSO:1 NY/T3195-20187H200.5g，NaCl0.1g,CaCl2-2H200.13g，酵母膏1.0g，蒸馏水1000mL。4.3.2粗毒素提取液制备从培养7d的cas2亚型和cas5亚型多主棒孢病原菌菌落边缘打取3个直径5mm的菌饼，接种于装有150mL的改良Fries3号培养液（培养液的配方见4.3.1）中，（25土1）℃恒温箱12h光暗交替静置培养12d。将培养的菌液先用2层无菌纱布过滤；滤液于室温5000r/min离心10min；上清液先用0.45um的针筒式微孔滤膜过滤器过滤；再用0.22um针筒式微孔滤膜过滤器过滤，最后一次滤液即为多主棒孢粗毒素提取液。制备好的粗毒素提取液于4℃冰箱保存备用。5抗病性鉴定5.1病原菌菌饼接种鉴定5.1.1鉴定设计鉴定时设IAN873”为抗病对照品系，“PR107”为感病对照品系。每个品系选取5片无病斑、完整的橡胶树淡绿期小叶，每片小叶作为1个重复，每个重复设4个接种点，其中1个接种点为空白对照。5.1.2接种用无菌的牙签在接种点处轻轻刺伤，将病原菌菌饼有菌丝的一面贴于叶片接种点的伤口处，对照则用空白PDA培养基贴于伤口处，用无菌的滤纸片蘸无菌水贴于菌饼上，叶片按品系贴好标签，置于（28士1）℃保湿培养。24h后去除菌饼，继续保湿培养。5.1.3数据统计接种处理3d后进行调查。采用十字交叉法量取发病叶片病斑的直径，单位为厘米（cm），计算每张小叶和品系平均值。5.2粗毒素生物萎法