SC_T 7225-2017草鱼呼肠孤病毒逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）检测方法.pdf

ICS 65.020.30B 41SC中华人民共和国水产行业标准SC/T 7225—2017草鱼呼肠孤病毒逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP）检测方法Detection method by reverse transcription loop-mediated isothermal amplificationfor grass carp reovirus2017-06-12发布2017-10-01实施中华人民共和国农业部发布 SC/T 7225—2017前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由农业部渔业渔政管理局提出。本标准由全国水产标准化技术委员会（SAC/TC156)归口。本标准起草单位：浙江省淡水水产研究所。本标准主要起草人：沈锦玉、郝贵杰、潘晓艺、徐洋、袁雪梅、尹文林、姚嘉赞、蔺凌云。I SC/T7225—2017引言本文件的发布机构提请注意，声明符合本文件时，可能涉及到6.3中RT-LAMP引物与《草鱼呼肠孤病毒I型IⅡ型Ⅲ型RT-LAMP可视化检测试剂盒及其检测方法》（专利号：201410683383.7）及《草鱼呼肠孤病毒I型ⅡI型Ⅲ型RT-LAMP荧光检测试剂盒及其检测方法》（专利号：201410684920.X)等相关的专利的使用。本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场。该专利持有人已向本文件的发布机构保证，他愿意同任何申请人在合理且无歧视的条款和条件下，就专利授权许可进行谈判。该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案。相关信息可以通过以下联系方式获得：专利持有人：浙江省淡水水产研究所地址：浙江省湖州市吴兴区杭长桥南路999号请注意除上述专利外，本文件的某些内容仍可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。II SC/T 7225—2017草鱼呼肠孤病毒逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）检测方法1范围本标准描述了草鱼呼肠孤病毒逆转录环介导等温扩增检测的技术原理，规定了试剂和材料、器材和设备、操作步骤及结果判定本标准适用于草鱼呼肠孤病毒基因I型、Ⅱ型和Ⅲ型的初筛检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T18088出人境动物检疫采样SC/T7103水生动物产地检疫采样技术规范3缩略语下列缩略语适用于本文件。AMV酶：AMV逆转录酶（avianmyelobastosisvirus reversetranscriptase）Bst酶：BstDNA聚合酶（大片段）[BstDNApolymerase(largefragment)]dNTP：脱氧核苷三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate）RdRp：草鱼呼肠孤病毒RNA依赖性的RNA聚合酶（RNAdependentRNApolymerase）RNA：核糖核酸（ribonucleicacid)RT-LAMP：逆转录环介导等温扩增（reverse-transcription loop-mediated isothermal amplification)4技术原理分别根据草鱼呼肠孤病毒基因I型、Ⅱ型及Ⅲ型RdRp基因序列(参见附录A)设计特异性内引物、外引物及环状引物各1对，特异性识别靶序列上的8个独立区域，利用Bst酶启动循环链置换反应，在RdRp基因序列启动互补链合成.形成茎一环DNA混合物，加入显色液，即可通过颜色变化观察判定结果。5试剂和材料5.1水：应符合GB/T6682中一级水的要求；DEPC水自配（见附录B中B.1)或购买商品化产品。5.2阳性对照：各基因型病毒阳性组织、细胞培养物或含目的片段的RNA。5.3RT-LAMP引物：引物分为A、B、C三组，A为基因I型,B为基因IⅡ型,C为基因Ⅲ型,序列参见附录A。各组引物10倍浓缩液浓度分别为：F3/B32μmol/L、FIP/BIP16μmol/L、LF/LB8μmol/L；引物浓缩液D为三组引物混合配置，浓度同A、B、C。一20℃保存备用。5.4Bst酶：一20℃保存，酶浓度为8U/μl，避免反复冻融。5.5AMV酶：一20℃保存，浓度为5U/μl..避免反复冻融。5.610XThemoPol聚合酶缓冲液：一20℃保存.含0.2mol/L.Tris-HCl、0.1mol/LKCl、0.1mol/LI SC/T 7225—2017(NH,)2SO.20mmol/LMgSO)和1%TritonX-100。5.7硫酸镁溶液（MgS(),）：一20℃保存，浓度为100mmol/L。5.8甜菜碱：浓度为5mol/L，一20℃保存，避免反复冻融（见B