SNT 2124-2008大西洋鲑鱼三代虫检疫技术规范.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2124—2008大西洋鲑鱼三代虫检疫技术规范Protocol of quarantine for Gyrodactylosis ofAtlantic salmon (Gyrodactylus salaris )2008-09-04 发布2009-03-16 实施中华人民共和国发布10国家质量监督检验检疫总局过素后线 105815素查减氮(数码防伪 SN/T 2124—2008前言本标准修改采用了国际兽疫局（OIE)《水生动物疾病诊断手册》(2006版)的第2.1.14章。本标准与《水生动物疾病诊断手册》(2006版)的第2.1.14章相比，主要差异如下：对聚合酶链式反应和扩增产物的电泳过程进行了优化；重新编排了格式。本标准的附录 B是规范性附录,附录 A、附录 C、附录 D、附录 E、附录 F、附录 G是资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中华人民共和国广东出人境检验检疫局。本标准主要起草人：刘、邱杨、江育林、史秀杰、何俊强、高隆英、叶奕优。本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 SN/T 2124—2008大西洋鲑鱼三代虫检疫技术规范1范围本标准规定了大西洋鲑鱼三代虫显微镜检和聚合酶链反应(PCR)检测方法。本标准适用于大西洋鲑鱼三代虫的检疫。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的必威体育精装版版本。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682-2008,ISO3696：1987,MOD)3概述大西洋鲑鱼三代虫简介参见附录A。4试剂和材料4.1水：符合GB/T6682中一级水的规格。4.2甲醛：分析纯。4.3乙醇：分析纯。4.4Tag酶：一20 ℃保存,不要反复冻融或温度剧烈变化。4.5 dNTPs:含 dCTP、dGTP.dATP、dTTP 各 10 mmoL/L。4.6引物：浓度为40 μmol/L。其序列如下：ITS-1:5-TTT CCG TAG GTG AAC CT-3ITS-2:5-TCC TCC GCT TAG TGA TA-3扩增内部转录间隔区(ITS)中的1300 bp片段,退火温度为50℃。IGS-1:5-CTG GCT ATA ATC ACG TAA GAC TGC-3IGS-2:5-AAG ATA CTC ATT TGA CTC GGT GTG-3扩增基因间隔区(IGS)中的 738 bp的片段,退火温度为55℃。LA:5-TAA-TCG-GCG-GGT-TCG-GTA-A-3HA 5-GAA-CCA-TGT-ATC-GTG-TAG-CA-3扩增线粒体细胞色素氧化酶I基因中的893bp的片段，退火温度为50℃。4.7异丙醇:分析纯,使用前预冷到20℃。4.8矿物油：要求无DNA酶和 RNA酶，用于无热盖的 PCR扩增仪。4.9相对分子质量标准。4.10其他试剂见附录 B。5 器材和设备5.1解剖镜。5.2 水浴锅。5.3 恒温箱。 SN/T 2124-20085.4普通冰箱和超低温冰箱。5.5台式离心机。5.6PCR 扩增仪。5.7水平电泳仪。5.8微量移液器。5.9紫外观察灯或凝胶成像仪。5.10制冰机。5.11显微镜。6　大西洋鲑鱼三代虫的检查和固定6.1大西洋鲑鱼三代虫的检查检查时，将鱼放在盛有运输时所用水的容器中，将鱼完全淹没。用针刺鱼脑，将鱼杀死，以免鱼血污染水。将鱼放在具有良好光线的双简解剖镜下逐条检查，检查鱼的体表，包括鳃和口腔。在缺乏活鱼检查的条件下，用10%甲醛或85%乙醇溶液固定鱼体！用甲醛固定的鱼，三代虫标本呈白色;用乙醇固定的鱼，三代虫呈轻微的暗黄色。检查前将装有鱼的容器放在自来水龙头下，让水流轻轻地通过容器冲洗约2h。在冲洗之前，先要分别检查固定鱼所用的固定剂，包括容器底部的沉淀物，看在固定和运输的过程中有无三代虫从鱼的身体上掉下来。6.2大西洋鲑鱼三代虫的固定一条寄生虫放到水滴上，轻轻地盖上盖玻片，用一块滤纸在盖玻片先加一滴水到载玻片上，然后将的边缘慢慢吸水，直到水基本吸干为止。注意水不要吸得太干，以免压碎虫体。接着滴一小滴 APG(见附录B第B.1章)到盖玻片的边缘，直至APG溶液浸满盖玻片与载玻片之间的空隙。在玻片上做好标签，标签上要注明宿主种类、虫体的寄生部位、采集地点、采集日期和水温。7大西洋鲑鱼三代虫的形态学鉴定大西洋鲑鱼三代虫的形态测量及形态学描述见表1，并参见附录C,和附录D。虫体来自鲑的幼鱼和虹鳟，进行虫