SN_T 4404-2015菜豆金色花叶病毒属病毒PCR筛查方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4404—2015菜豆金色花叶病毒属病毒PCR筛查方法Screening protocol for Begomovirus by PCR2016-07-01实施2015-12-04发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局层李 SN/T 4404—2015前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国福建出人境检验检疫局、云南省烟草农业科学研究院、沈阳大学、中国检验检疫科学研究院、福建农林大学。本标准主要起草人：沈建国、于文涛、李敏、方敦煌、杨彩霞、林春滢、蔡伟、张永江、高芳銮、吴祖建。I SN/T4404—2015菜豆金色花叶病毒属病毒PCR筛查方法1范围本标准规定了菜豆金色花叶病毒属病毒PCR筛查方法。本标准适用于寄主植物中菜豆金色花叶病毒属病毒的检测鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用手本文件。SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样3菜豆金色花叶病毒属基本信息中文名称：菜豆金色花叶病毒属英文名称：Begomovirus分类地位：双生病毒科（Geminiviridae）其他信息参见附录A。4方法原理Begomovirus 病毒的分子生物学特性是制定本检疫鉴定方法的主要依据。根据Begomouirus 病毒的DNA保守区域设计特异性引物建立该属病毒的分子生物学筛查寿法.2R5主要仪器设备高速冷冻离心机、PCR仪、凝胶成像分析系统等。6检测与鉴定6.1抽样抽样方法按照SN/T2122中规定执行。6.2PCR检测方法按照附录B给出的方法，进行PCR检测。6.3序列测定与分析将PCR产物回收后，进行克隆、测序，测定的核苷酸序列与已知Begomovirus病毒序列进行比对。如果与已知的Begomovirus 病毒序列同源性大于89%,则判定为 Begomoirus 病毒；同源性小于 89%1 SN/T 4404—2015则初步判定为Begomovirus属病毒的新种，若需进一步鉴定到具体病毒种类，应结合病毒生物学特性。注：序列比对可利用NCBI网站上的BLAST软件进行，网址为http：///BLAST/7结果判定7.1采用PCR方法检测，如果阳性对照、阴性对照和空白对照正常，待测样品未出现与阳性对照一致的扩增条带，则判定为未检出。7.2采用PCR方法检测，如果阴性对照和空白对照无特异性扩增，待测样品出现与阳性对照一致的扩增条带，且测定的序列为Begomouirus 病毒,则判定为检出。8结果记录记录样品信息和检测数据，包括样品来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果以及实验人员签字。PCR检测方法应保存电泳照片，测序结果保存测序报告图。9样品保存检测结果判定为阳性的样品应妥善保存在一80℃超低温冰箱中，并作好登记和标记，以备复核用。保存期满后，需经灭活处理。2 SN/T 4404—2015附录A（资料性附录）Begomovirus病毒基本信息A.1分类地位双生病毒科（Geminiviridae）。该病毒属所在的双生病毒科的组成结构见表A.1。表A.1双生病毒科的组成结构属(Genus)代表种（Typespecies）玉米线条病毒玉米线条病毒MastrevirusMaize streak virus曲顶病毒甜菜曲顶病毒双生病毒科CurtovirusBeet curly top virus伪曲顶病毒番茄伪曲顶病毒TopocuvirusTomato pseudo-curlytopvirus菜豆金色花叶病毒菜豆金色花叶病毒BegomovirusBean golden yellow mosaic virusA.22寄主范围寄主广泛，主要侵染双子叶植物，包括烟草、番茄、辣椒、棉花、甜瓜、木瓜、南瓜、西瓜、豇豆、巴豆、利马豆、大翼豆、绿豆、菜豆、茴麻、木薯、藿香蓟等。A.3分布地区该属病毒主要分布于热带、亚热带及温带地区。A.4传播途径自然传播介体为烟粉虱（Bemisiatabaci），以持久性方式传播。远距离传播主要通过带毒苗木传播。A.5病毒粒体形态双联体结构，无包膜，由两个不完整的二十面体组成。A.6病毒的基因组结构人多数Begomouirus包含2个单链环状DNA（ssDNA）组分，长度相似，每条为2.5kb～2.6kb。少数病毒为单个组分，已发现单组分病毒常常含有环状卫星ssDNA(DNA-β）。3 SN/T 4404—2015附录B（规范性附录）PCR检测方法B.1主要试剂B.1.1CTAB提取缓冲液:20 g/L CTAB,1.4 mol/LNaCl,0.