SN 1421-2004猪水疱病病毒微量血清中和试验.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1421—2004猪水疱病病毒微量血清中和试验Micro-serum neutralization test for swine vesicular disease virus2004-06-01发布2004-12-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局数码防保 SN/T 1421—2004前本标准的附录 A是规范性附录,附录 B是资料性附录。本标准由国家认证认可监督委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国珠海出人境检验检疫局。本标准主要起草人：杨素、潘文波、廖秀云、冯家望。本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。一 SN/T 1421—2004猪水疱病病毒微量血清中和试验1范围本标准规定了猪水疱病病毒微量血清中和试验方法。本标准适用于猪水疱病病毒中和抗体的检测。2缩略语下列缩略语适用于本标准2. 1CPE:致细胞病变作用。2. 2TCID5o:半数细胞感染量。2.3SVD:猪水疱病。3原理特异性的血清中和抗体与病毒结合后，能使病毒失去对敏感细胞的感染能力，从而阻止病毒的繁殖。这一反应不但表现为一种病毒只能被相应的免疫血清所中和,而且还表现在中和一定量的病毒，必须有一定效价的免疫血清。本标准规定的中和试验是以定量病毒稀释血清为基础，当血清能阻止定量病毒50%致细胞病变能力时,其血清的稀释度即为其效价。因而本中和试验是一种定量测定猪水疱病血清抗体的方法。4试剂和材料4.1本标准所用试剂配制见附录 A。4.2本标准试剂除特殊规定外,均指分析纯试剂。4.3本标准所用试剂、玻璃器血除有特殊规定外，均需高压灭菌。4.4病毒:用经蚀斑法纯化并经血清学鉴定的猪水疱病病毒作为标准病毒。4. 5 标准血清:标准阴性血清采用无 SVD 病毒抗体的猪血清,标准强阳性和弱阳性血清采用 SVD病毒感染发病后康复的猪血清。4. 6 细胞系:IB-Rs-2 传代细胞系。4.7细胞培养液:含 10%胎牛血清(经 56℃,30 min灭能)及抗生素的细胞培养液。4.8细胞维持液:含 2%胎牛血清(经 56℃,30 min 灭能)及抗生素的细胞维持液。4.9细胞分散液。4.10固定液。4.11染色液。5器械和设备5. 1二氧化碳培养箱、微量振荡器、倒置显微镜、冰箱、超声波细胞破碎仪。5.2100 mL细胞培养瓶、96孔微量细胞培养板、吸头、多道可调移液器、单道可调移液器。 SN/T 1421—20046预备试验6.1将 SVD病毒接种IB-Rs-2细胞单层，37℃吸附1h后加人维持液，置 5%二氧化碳培养箱于37℃培养，接种24h后用倒置显微镜逐日观察，待CPE达75%以上，冻融一次或置冰浴中用超声波处理（40uA，1min），2000r/min离心20min，上清液分装小瓶，每瓶1mL，置-70℃保存备用。6.2病毒毒价的测定及其工作浓度的配制:将病毒原液用细胞维持液做10 倍系列稀释至10-10,每个稀释度作8个孔，每孔50μL，每孔加50μL工作细胞液，再补充细胞维持液50μL。每块板设4孔正常细胞对照，于5%二氧化碳培养箱37℃培养，从48h开始至96h用倒置显微镜逐日观察记录CPE，按Karber 方法计算TCIDso。将病毒原液配制成 100TCID5o/50 μL,备用。6.3将标准阳性血清、阴性血清、被检血清经 56℃ 30 min灭能,备用。6.4将细胞用细胞培养液稀释成工作细胞液（10个细胞/mL），备用。7中和试验7.1对照设立7.1.1细胞对照：设 4孔正常细胞对照，每孔加工作细胞液50μL、细胞维持液100μL。7.1.2强阳性血清对照：将已知滴度的标准强阳性血清用细胞维持液在96孔微量培养板上从1：4开始做倍比系列稀释，每个稀释度作5个孔（50μL/孔），4孔加100TCIDso/50μL病毒悬液50uL，微量振荡器振荡混勾，置5%二氧化碳培养箱37℃中和1h，再加人工作细胞液50μL/孔。余下的一孔作为7.1.6所描述的血清毒性对照。7.1.3弱阳性血清对照：将已知滴度的标准弱阳性血清用细胞维持液在 96孔微量培养板上从1：4 并始做倍比系列稀释，每个稀释度作5个孔（50μL/孔），4孔加100TCID5/50μL病毒悬液50μL，微量振荡器振荡混勾，置5%二氧化碳培养箱37℃中和1h，再加人工作细胞液50μL/孔。余下的一孔作为7.1.6所描述的血清毒性对照。7.1.4阴性血清对照:设5孔阴性血清对照，4孔加阴性血清和100TCIDso/50μL病毒悬液各50μL，再加人工作细胞液50μI。余下的一孔作为7.1.6所描述的血清毒性对照。7.1.5病毒回归对照：将病毒稀释为 1 000 TCIDso/50 μL、100TCID5o/50 μL、10TCID5o/