DB11_T 829-2011白菜品种纯度及真实性分子检测方法.pdf

ICS65.020.20B 21备案号：DB11北京市地方标准DB11/T829—2011白菜品种纯度及真实性分子检测方法Methods of identifying varietal purity and genuineness of Chinesecabbage by using molecular markers2011-11-10发布2012-03-01实施北京市质量技术监督局发布 DB11/T 829—2011目次前言I范围.2规范性引用文件3术语与定义4原理。5仪器设备及耗材，6试剂和溶液配制引物选用原则及筛选方法8操作步骤。6检测结果。附录A（规范性附录）所用溶液的配置方法附录B（资料性附录）白菜品种纯度检测常用的SSR引物名称及序列11附录C（资料性附录）白菜真实性鉴定常用的ISSR引物名称及序列13附录D（规范性附录）白菜基因组DNA提取方法附录E（规范性附录）6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法附录F（规范性附录）5%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法19 DB11/T 829—2011附录A（规范性附录）所用溶液的配置方法A.1DNA提取溶液的配制A.1.11mo1/L Tris-HCI (pH 8.0)称取三羟甲基氨基甲烷（Tris）121.1g溶于800ml蒸镐水中，用HCI调节pH值至8.0后，加蒸馏水定容至1000ml，高压灭菌。A.1.2 0.5 mo1/L EDTA(pH 8.0)称取乙二胺四乙酸二钠盐（EDTANa·2H:0）186.1g溶于800mI蒸馏水中，用NaOH调节pH值至8.0（约雷NaOH颗粒20g），加蒸馏水定容至1000ml，高压灭菌，A.1.3320%十二烷基硫酸钠（SDS）称取十二烷基硫酸钠（SDS）20g缓慢加入到60mI蒸馏水中，边加热边搅拌，完全溶解后加蒸馏水定容至100mlA.1.41%SDS-DNA提取液称取氯化钠（NaCI）58.44g溶于700mL蒸馏水中，加入20%十二烷基硫酸钠（SDS）50mL，1mo1/LTris-HCI(pH8.0)100mL，0.5mo/LEDTA(pH8.0)20mL，加蒸馏水定容至1L，分装后高压灭菌。A.1.5饱和酚：氯仿：异戊醇混合液(25:24:1)25份饱和酚:24份氯仿：1份异戊醇（v/V）A.1.6570%乙醇溶液30份水:70份无水乙醇（v/v）A.1.7TE缓冲液（pH8.0）取1mo1/LTris-HCI（pH8.0）10mL和0.5mo1/LEDTA（pH8.0）溶液2mL，加蒸馏水定容至1000mL,高压灭菌。A.1.83mo1/L乙酸钠溶液称取乙酸钠（NaAc）40.8g落于80mI蒸馏水中，用冰乙酸调节pH值至5.2，加蒸馏水定容到100ml，高压灭菌。A.2PCR扩增试剂配制A.2.1INP00 DB11/T 829—2011用超纯水分别配制ATP、GTP、CTP、TTP终浓度为100mmo1/L的储存液，各取20μL混合，加入720μL超纯水定容至终浓度2.5mmo1/L的工作液（也可直接购实2.5mmo1/L的dNTP商品落液），=20℃保存。A.2.210μmol/L引物溶液用超纯水或TE缓冲液分别配制上、下游引物至终浓度为20Hmo1/L的储存液，等体积混合成10Hmo1/引物落液。A.3聚丙烯酰胺凝胶电泳溶液配制A.3.16倍变性加样缓冲液量取甲酰胺49mL，加入0.5mo1/LEDTA（pH8.0）1mL，演酚兰0.125g，二甲苯青FF0.125g，混匀，A.3.26倍非变性加样缓冲液F0.125g，混匀。A.3.310×TBE缓冲液称取三羟甲基氨基甲烷（Tris）108g，硼酸55g，加适量去离子水溶解后，再加入0.5mol/LEDTA（pH8.0）37mL，去离子水定容至1000mLA.3.46%变性聚丙烯酰胺凝胶落液去离子水落解后，加入100mL10×TBE溶液，加去离子水定容至1000mL，混匀，过滤。A.3.55%非变性聚丙烯酰胺凝胶溶液称取48.14g丙烯酰胺，1.66gN，N-亚甲基双丙烯酰胺，倒入1000mL烧杯中，加入700mL去离子水溶解后，加入100mL10×TBE溶液，加去离子水定容至1000mL，混匀，过滤。A.3.6亲和硅烷（bind-silane）缓冲液量取无水乙醇49.75mL和冰乙酸250pL，混匀.A.3.70.5%亲和硅烷（bind-silane）在9.95mL亲和硅烧缓冲液中加入50L亲和硅烧原液，混匀，A.3.825%过硫酸铵称取0.25g过硫酸铵，加1mL去离子水溶解，现用现配。A.3.991×TBE缓冲液量取10×TBE500mL，加4500mL去离子水，混匀。A.4银染试剂配制9 DB11/T 829—2011A.4.1固定液量取冰乙酸10