CJ 149-2001城市供水 亚硫酸还原厌氧细菌孢子的测定 1、液体培养基增菌法 2、滤膜法.pdf

CJ/T 149--2001前言本标准由建设部标准定额研究所提出。本标准由建设部给水排水产品标准化技术委员会归口。本标准由国家城市供水水质监测网广州监测站负贵起草。本标准起草人：林朝晖。本标准参加验证单位：北京监测站、上海监测站、天津监测站、深圳监测站、成都监测站及顺德监测站(省级）。51 中华人民共和国城镇建设行业标准城市供水亚硫酸盐还原庆氧菌CJ/T 149-- 2001(梭状芽胞杆菌)孢子的测定Urban water supply-Determination of the spores of sulfite-reducing anaerobes (clostridia)1．液体培养基增菌法1. Method by enrichment in liquid medium1范围本标准规定了用液体培养基增菌法测定城市供水及水源水中亚硫酸盐还原厌氧细菌孢子。本标准适用于城市供水及水源水中亚硫酸盐还原厌氧细菌孢子的测定。2 方法取一定体积的水样。首先用加热法选择水样中的孢子，加热时间应足以杀死营养型细菌。将水样接种于培养液中，然后于37C士1℃厌氧培养44 h士4 h。由于亚硫酸盐还原厌氧细菌能把培养液中的亚硫酸盐还原为硫化铁（Ⅱ）是黑色沉淀，则培养液变黑为阳性。3试剂和材料3.1 单一强度的基本培养基3.1.1成分蛋白陈10 g牛肉膏10 g酵母浸膏1.5 g淀粉1g乙酸钠（含水）5gL-半胱氨酸盐酸盐0.5 g葡萄糖1g蒸馏水1 000 mL3.1.2制法将蛋白陈、牛肉膏、乙酸钠和酵母浸膏混合于 800 mL水中。用200mL蒸馏水制备淀粉液，步骤如下：把淀粉置于少量的冷水中调成浆糊状。把剩下的水加热至沸，在搅拌中慢慢倒人浆糊状淀粉中。将此淀粉液与前述800mL混合液混合，加热至沸，使全部溶解。中华人民共和国建设部2001-07-17批准2001-12-01实施52 CJ/T 149—2001最后再加人葡萄糖和L半胱氨酸盐酸盐，使其溶解。用 NaOH(1 mol/L)溶液调 pH值至 7.1～7.2,分装 10 mL 培养基溶液到 25 mL 带盖螺口玻璃瓶中，冷却后，拧紧瓶盖。121℃±1℃高压灭菌 15 min:3.2双强度基本培养基制备双强度基本培养基的过程与单强度的基本培养基（3.1)同，但水的体积要减少一半。将10mL或50mL双强度培养基溶液分别将在25mL或100mL螺口瓶中，121℃土1℃高压下灭菌15 min.3.3亚硫酸钠(Na2SO:)溶液4g无水亚硫酸钠溶于100mL水中，用0.2μm滤膜过滤除菌。保存温度2℃~5℃。保存期14天。3.4柠檬酸铁(CH.O,Fe)溶液7 g柠檬酸铁溶于 100 mL 水中，用 0.2 μm滤膜过滤除菌。保存温度 2℃~～5℃。保存期 14 天。3.5完全培养基3.5.1分析时，将等体积的亚硫酸钠溶液（3.3)和柠檬酸铁溶液（3.4)混合。3.5.2在每瓶单一强度培养基中各加人0.5mL的混合溶液（3.5.1），此培养基应重新在沸水水浴上加热 15 min 并冷却。3.5.3在每瓶10mL的双强度培养基中各加人0.4mL 的混合溶液（3.5.1）,50mL 的双强度培养基中各加人2mL的混合溶液，此培养基也应重新在沸水水浴上加热15 min并冷却。4仪器4.1100mL和25mL螺口带盖玻璃瓶。4.250 ml、100 mL、10 mL 和 1 mL移液管。4.3恒温水浴锅。4.4 试管(150 mm×13mm)。4.5接种环。4.6恒温培养箱（保持温度37℃士1℃）。4.7细菌过滤器。5 测定步骤5.1孢子的选择水样在试验前须放置于75℃士5℃水浴锅中，加热15min，用同样带盖螺口瓶子作空白，检查加热温度。5.2 接种与培养将50mL水样置于含50mL双强度完全培养基（3.5.3)的100mL螺口瓶中。向5个含有10mL单一强度完全培养基（3.5.2)的25mL螺口瓶中，加入1mL水样。如果有必要，可向5个含有10mL单一强度完全培养基（3.5.2)的25mL螺口瓶中分别加人1mL稀释度为 1~～10 倍的水样稀释液。为定性检验100mL水样而无需进行最可能数（MPN)计算时，可向含有100mL双强度完全培养基(3.5.3)的200 mL螺口瓶中加人100 mL.水样。 CJ/T 149— 2001如有必要，可将单一强度完全培养基加至瓶颈处，以保证瓶中残留极少量的空气。拧紧瓶盖，将瓶密封，于无氧条件下培养。在37℃±1℃培养44h±4h。在接种前，将烧红的铁丝置于瓶内培养基中密封，可有助于厌氧培养。5. 3观察结果瓶子内部变黑为阳性。计数及报告结果根据试验阳性的瓶数。查MPN表（见表1和表2），即可得100mL水样中的亚硫酸盐还原厌氧细菌孢子数，乘 10即为 1