NY_T 4042-2021CN水貂病毒性肠炎诊断技术.pdf

ICS 11.220CCS B 41NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 4042—2021水貂病毒性肠炎诊断技术Diagnostic techniques for mink viral enteritis2021-12-15发布2022-06-01实施中华人民共和国农业农村部发布 NY/T 4042—2021目次前言引言范围规范性引用文件术语和定义缩略语临床诊断5. 1流行特点5. 2临床症状5. 3病理变化样品采集及处理6. 1仅器6. 2耗材·6. 3试剂，6. 4样品处理病原分离鉴定7. 1仅器7. 2耗材7. 3试剂，7, 4样品处理7. 5病毒分离鉴定血凝和血凝抑制实验(HA-)8. 1仪器8. 2耗材8. 3试剂8. 4HA 38. 5HI实8. 6质控标准8. 7结果判定PCR检测仪器9. 2耗材9. 3试剂9. 4DNA提取9. 5PCR 检测9. 6质控标准9. 7结果判定10荧光PCR检测10. 1仅器10. 2耗材 NY/T 4042—20219. 3. 2dNTP(含 dCTP,dGTP,dATP,dTTP 各 10 mmol/L),9. 3. 310XTaqDNA聚合酶缓冲波。9. 3. 420℃保存的5U/μLTaq酶，9. 3. 5结构蛋白VP2基因保守区引物(浓度为10μmol/L，见附录E中的E.1)。9. 3. 61XTAE电泳缓冲液（见E.2)，9.3. 71%的琼脂糖凝胶(见E.3)。9.3.8商品化无毒核酸染料。9. 3. 96X核酸电泳加样缓冲液(见E.4)。9. 3. 10商品化DL2000DNAMarker分子量标准，9.4DNA提取取6.4.5处理上清和7.5.5的病毒分离细胞培养液，应用市售的商品化病毒DNA提取试剂盒提取病毒DNA,作为PCR或荧光PCR模板。9.5PCR检测9.5.1PCR反应体系在超净工作台中按剂量要求在0.2mLPCR管中依次加人PCR反应试剂。同时设不加模板空自对照，已知阳性对照及正常水貂组织或者CRFK正常细胞处理上清作为模板的阴性对照，PCR采用25μL反应体系：灭菌水16 μLdNTPs(2. 5 mmol/L)2 μL10XTaqDNA聚合酶缓冲液2. 5 μLTaq DNA 聚合酶(5 U/μL)0. 5 μL正向引物(10μmol/L)1 μL反向引物(10μmol/L)1 μL模板 DNA(10 ng/μL~20 ng/μL)2 μL总量25 pμL9. 5. 2扩增程序及反应条件将混匀的PCR管置于PCR仪上，按如下程序扩增：95C预变性5min；94℃变性45s，53C退火30°s，72℃延伸50s，40个循环；最后72C延伸10min，9.5.3PCR产物电泳检测9. 5. 3. 1用1×TAE电泳缓冲液配制1%的琼脂糖凝胶溶液100mL，加热使琼脂糖溶解，冷却至50℃~60℃C.加入无毒核酸染料溶液20L，充分混匀后倒凝胶平板，9.5. 3.2将冷却的凝胶平板放人水平电冰槽，加人1XTAE泳缓冲液刚好没过胶面。9. 5. 3. 3每个PCR管吸取5LPCR产物和1L6×加样缓冲减混匀后分别加入样品孔，9.5. 3.4同时设DL2000DNAMarker分子质量标准作参照。9.5. 3.5100V恒压电泳30min，当澳酚蓝达到琼脂糖凝胶底部时停止电泳，用凝胶成像系统观察结果。9.6质控标准阴性对照和空白对照未出现目的条带，阳性对照出现特异性的573bp目的条带，满足以上2个条件，实验结果成立，9.7结果判定9.7.1若被检样品扩增出大小为573bp的PCR产物(见E.5)，测序结果与参考序列(见E.6)的同源性大于99%，则判定被检样品MEV核酸阳性。9.7.2若被检样品未扩增出573bp特异性条带，判定为性。9.7.3若出现与扩增长度不同大小的条带为非特异性反应，需要重复实验，2次实验均为非特异条带可6 NY/T 4042—2021判定为阴性。10荧光PCR检测10.1仪器10. 1. 1 微量移液器(200 μL~1 000 μL,20 μL~200 μL,2 μL~20 μL,0. 5 μL~10 μL),10.1.2荧光定量PCR仪。10.1.3涡旋混匀器。10.2耗材10.2. 1吸头(1 000 μL,200 μL,20 μL,10 μL),10.2. 2荧光定量PCR管。10.3试剂10. 3. 1除特别说明以外，本文件所用试剂均为分析纯，实验用水符合GB/T6682分析实验室用水规格10.3.22XPremix Ex Taq(Probe qPCR)反应预混液。10.3.3引物及MGB-TaqMan探针及参考序列(见附录F中的F.1和F.2)。10.3.4MEV阳性对照、阴性对照样品。10.4DNA提取按