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热休克蛋白 70 减轻帕金森病细胞模型中 α-突触核蛋白毒性的作用 【摘要】 目的探讨HSP70 在因 α-突触核蛋白过表达或突变所致的帕金森病(PD) 细胞模型中的作用及其机制。方法构建过表达野生型和 PD 相关突变型(A53T)α- 突触核蛋白质粒，转染人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)细胞后得 PD 细胞模型; 然后在细胞模型中转染表达 HSP70 的质粒。采用免疫印迹检测转染 HSP70 细胞 模型中 α-突触核蛋白表达量的改变;采用 MTT 法检测转染 HSP70 后细胞模型活 力的变化。结果转染 HSP70 后，细胞模型 α-突触核蛋白表达减少，细胞活性增 加。结论 HSP70 通过降低 α-突触核蛋白表达水平对 PD 细胞模型发挥保护作用。 【关键词】 α-突触核蛋白;热休克蛋白 70;过表达 α-突触核蛋白是一种在中枢神经系统突触前表达的可溶性蛋白,具有调节膜稳 定性和神经可塑性等生理功能。近年研究发现，α-突触核蛋白基因过表达或突变 可引起 α-突触核蛋白的错误折叠、有毒蛋白寡聚体和多聚体的形成，使其结构和 功能障碍，从而启动一系列级联反应致多巴胺能系统损伤，最终导致帕金森病 (PD) 。研究认为神经保护剂可能是治疗 PD 的一个新的有效途径，而热休克蛋白 70(HSP70)就是其中之一。HSP70 是分子伴侣家族中的一员,作为一种重要的应激 蛋白,能与 错误折叠的蛋白相互作用，阻止聚集物的形成;除此之外，HSP70 还 有助于错误折叠蛋白的降解 〔1，2 〕。在果蝇及酵母的 PD 模型中发现，HSP70 能减轻 α-突触核蛋白的毒性及其引起的神经细胞凋亡 〔3，4 〕,而 HSP70 抑制 α- 突触核蛋白毒性可能与其能够与 α-突触核蛋白相互作用，阻止 α-突触核蛋白纤 维样聚集，降低α-突触核蛋白表达量有关 〔5，6 〕。为进一步证实 HSP70 在 α- 突触核蛋白所致 PD 的作用，本实验首次在神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)PD 模型 中检测了HSP70 的作用及机制，发现 HSP70 可以通过降低 α-突触核蛋白水平发 挥对 PD 细胞模型的保护作用。 1材料与方法 1.1 实验材料 SH-SY5Y 细胞购自 ATCC 公司;限制性内切酶购自Takara 公 司;QIAprep TIP100 Kit 购自 QIAGEN 公司;人胎脑 cDNA 文库、胎牛血清(FBS)、 Lipofectamine2000 购自 Invitrogen 公司;蛋白酶抑制剂 cocktail 购自 Sigma 公 司;anti-α-synuclein 204 抗体、anti-beta-actin 抗体购自 Santa cruz 公司;聚偏二氟乙 烯(PVDF)膜购自 Millipore 公司。 1.2 方法 1.2.1 质粒构建以人胎脑 cDNA 文库为模板，PCR 获得 α-突触核蛋白可编码 序列(CDS 序列) 以Not Ⅰ和 HindⅢ连接到 pCDNA3.1 真核表达载体中，通过 overlap PCR 方法，构建 A53T 突变体，同样以Not Ⅰ和 HindⅢ连接到 pCDNA3.1 真核表达载体中。按照 QlAprep TIP100 Kit Protocol 抽取并纯化质粒，测序证实。 pCDNA3.1-HSP70 质粒由湘雅二医院肝移植中心李杰群博士惠赠。 1.2.2 细胞培养与转染 SH-SY5Y 细胞采用含 10%FBS 的高糖DMEM 培养液， 置于 37℃，5%CO2 的培养箱培养。转染严格按照 Lipofectamine2000 说明书进行。 用不含 FBS 的DMEM 培养基洗涤细胞 2 次，24 孔细胞培养板每孔加入含 2 μl Lipofectamine2000 及 0.8 μg 质粒 DNA 、不含 FBS 的DMEM 培养基 500 μl，在 37℃，5%CO2 的培养箱中孵育3 h，改用含 10%FBS 的DMEM 培养基继续孵育 48 h 。 1.2.3 免疫荧光将稳定表达蛋白的 SH-SY5Y 细胞接种到有盖玻片的 24 孔板 中，用含 10% FBS 的DMEM 培养于 37℃、5% CO2 培养箱中 36 h 后，弃去培 养基，3.7% 的多聚甲醛/磷酸缓冲液(PBS)室温下固定 15 min。PBS 洗 2 次，每次 5 min 。0.2% 的TritonX-100/PBS 透化 10 min，PBS 洗 2 次，5%牛血清白蛋白(BSA) 封闭液，室温封闭 30 min 。