E3泛素连接酶FBXW7在食管鳞状细胞癌中的表达及对其生物学行为的影响.docxVIP

? ? E3泛素连接酶FBXW7在食管鳞状细胞癌中的表达及对其生物学行为的影响 ? ? 何尚峰，卢香云，马琰迪，孙 琦，高海霞，张洪攀，阿米尔，俞雪燕，禹 洁，王文洁，陈云昭，李 锋,，崔晓宾, 食管癌(esophageal carcinoma，EC)在全球所有癌症中发病率居第七位，病死率居第六位[1]，有两种主要的组织学亚型(鳞状细胞癌和腺癌)，其中食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)是我国EC中的主要亚型，临床表现为侵袭性且预后不良[2]。泛素-蛋白酶体系统是介导真核生物蛋白质降解的关键组分[3]，主要由3种蛋白质组成：泛素激活酶(E1)、泛素结合酶(E2)和泛素连接酶(E3)，3种酶的共同协作，完成对底物蛋白的识别及泛素化降解[4]。F框/WD-40域蛋白7(F-box and WD-40 domain protein 7,FBXW7)作为E3泛素连接酶中RING家族的一员，参与降解多种已知的原癌蛋白，包括c-MYC、Cyclin E、NOTCH、MCL1、mTOR、c-JUN、AURKA，在多种癌症中作为肿瘤抑制因子发挥着重要作用[5]，而FBXW7在ESCC中的作用有待进一步研究。该研究旨在探究FBXW7在ESCC中的表达与生存预后的关系，以及FBXW7对ESCC细胞增殖、迁移和侵袭的生物学行为的影响。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1病例资料 本实验选取2000—2016 年间ESCC石蜡包埋组织样本共224例。其中癌组织171例，距离ESCC组织3 cm以上部位的癌旁组织53例，患者术前均未接受过放疗或化疗。由两名资深病理医师根据WHO(2019)消化系统肿瘤分类对 HE 切片进行复片，并参照2017年UICC/AJCC 第8版食管癌TNM分期标准进行分期。所收集的病例均得到患者的同意并签署知情同意书。并收集患者的个人资料、肿瘤分化程度、是否淋巴结转移及 TNM 分期等临床病理资料，通过电话等对患者进行随访，截至2020年8月或死亡日期。 1.1.2细胞株 本实验所用食管鳞癌细胞系Eca109和Eca9706均购买自上海复祥生物科技有限公司。 1.1.3试剂 FBXW7抗体(货号：ab109617)购自英国Abcam公司；胎牛血清(foetal bovine serum,FBS)、PBS缓冲液购自以色列BI公司；青链霉素混合液(货号：P1400)、4%组织细胞固定液(货号：P1110)、0.1%结晶紫染色液(货号：G1063)、5×蛋白上样缓冲液(货号：P1040)、1×TBST缓冲液(货号：T1085)购自北京索莱宝科技有限公司；RPMI-1640培养基购自美国Gibco公司；Lipofectamine2000转染试剂购自美国Invitrogen公司；FBXW7质粒由苏州吉玛基因股份有限公司构建；CCK-8 试剂盒(货号：MI00615)、ECL发光液(货号MI00607C)购自米鼠(西安)生物科技有限公司；基质胶购自美国Corning公司；PAGE凝胶快速制备试剂盒(货号：PG112)、无蛋白快速封闭液(货号：PS108P)购自上海雅酶生物医药科技有限公司；ENO1抗体(货号：sc-100812)购自美国Santa公司；GAPDH抗体(货号：AF0006)购自上海碧云天生物技术有限公司；辣根酶标记鼠二抗(货号：ZB-2305)、辣根酶标记兔二抗(货号：ZB-2301)：购自北京中杉金桥生物技术有限公司。 1.1.4主要实验仪器 细胞培养箱、超净台工作台、-80 ℃冰箱(美国赛默飞世尔科技有限公司)；酶标仪(美国ABI公司)；光学倒置显微镜(日本OLYMPUS公司)；4 ℃冰箱(中国海尔集团公司)；ECL Western成像仪(北京百晶生物技术公司)；电泳仪、湿转转膜仪(美国Bio-RAD 公司)。 1.2 方法 1.2.1免疫组织化学染色及评估 使用 EnVision 两步法进行免疫组化实验，使用FBXW7抗体，调整抗体稀释比例为1 ∶8 000。染色结果评分均由两位高年资的病理医师独立双盲法评定。FBXW7主要定位于细胞核中，以呈棕黄色颗粒为阳性。计分方法如下：①按细胞着色强度计分，无着色为0分，黄色为1分，棕黄色为2分，棕色为3分；②按肿瘤阳性细胞的百分比计分，3分为高表达。若对结果存在分歧则请第三位高年资的病理医师评定。 1.2.2细胞培养 将Eca109和Eca9706细胞培养于含10%胎牛血清、1%青链霉素的RPMI-1640细胞培养基中，并置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。当细胞密度达到80%进行换液及传代处理，进行后续实验。 1.2.3细胞转染 将处于对数生长期的细胞消化计数，每孔计数50万个细胞，培养过夜6～8 h