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细胞免疫荧光技术 当前第1页\共有17页\编于星期四\21点 实验目的 掌握免疫荧光技术的基本原理 熟悉细胞免疫荧光技术的方法 了解在免疫细胞化学技术中如何获得好的实验结果 当前第2页\共有17页\编于星期四\21点 实验原理 原位检测 抗原抗体特异反应 间接法 间接荧光抗体染色法示意图 抗原 抗体 荧光素标记的抗抗体 激发光 显示荧光 Hela细胞 Vinculin 当前第3页\共有17页\编于星期四\21点 实验用品 试剂： 固定液：4%PFA 细胞通透：0.2%TritonX 封闭试剂：10%正常山羊血清 一抗：小鼠源抗Vinculin单克隆抗体 二抗:Alexa Fluor555标记的山羊抗小鼠IgG DAPI（4’,6-二脒基-2-苯基吲哚） PBS洗涤缓冲液：PH7.4 材料： Hela细胞 细胞培养皿 仪器： 荧光显微镜 当前第4页\共有17页\编于星期四\21点 实验步骤 一，细胞制备和细胞固定 将细胞铺在 24孔板中 将细胞培养 至所需密度 加入4%PFA 固定10min 染色 或保存 PBS洗涤 PBS洗涤 当前第5页\共有17页\编于星期四\21点 实验步骤 二，细胞免疫荧光ICC染色 0.2% TritonX 处理5min 封闭 室温30min 4℃过夜 37℃1-2小时 37℃5-10min 荧光显微镜观察 加入一抗 加入二抗 加入DAPI复染 PBS 洗涤 PBS 洗涤 PBS 洗涤 当前第6页\共有17页\编于星期四\21点 实验结果 三，观察 ?human HeLa cells 当前第7页\共有17页\编于星期四\21点 实验中应注意的问题 细胞不要铺的过密:60-70% 防止细胞污染 固定时间不要太长,一般10-30min TrionX处理时间不宜过长，膜蛋白可不必处理 选择合适的封闭液 二抗孵育后,一定要洗干净 必要时用恒温摇床摇洗 当前第8页\共有17页\编于星期四\21点 1. 免疫荧光技术 2. 免疫酶技术 3. 免疫亲和技术 4. 胶体金技术 标记物 使抗体或抗原 抗体复合物在 各种显微镜下 可见的物质 免疫细胞化学技术 当前第9页\共有17页\编于星期四\21点 免疫细胞化学技术注意事项 选择合适的方法 材料要留好 选择抗体 选择标记酶 封闭液的选择 设定对照实验 当前第10页\共有17页\编于星期四\21点 思考题 检测Hela细胞中蛋白A定位情况，思考应选择什么方法， 用什么仪器观察？ A 当前第11页\共有17页\编于星期四\21点 疑难解答 一，缺乏染色 可能的原因 无抗原 抗体失效 固定不充分 过度固定 抗原修复无效 不兼容的二抗和一抗 漏用试剂或未按正确的顺序 加入试剂 相应的措施 用原位杂交方法检测蛋白表达 按说明书储存抗体;分装抗体;避免反复冻融 增加固定时间或改用不同的固定剂 减少固定时间;抗原修复 增加修复时间或更换修复液 使用可以与一抗结合的二抗 重复染色并确定使用的试剂和加入的顺序 当前第12页\共有17页\编于星期四\21点 二，高背景 当前第13页\共有17页\编于星期四\21点 可能的原因 一抗或二抗的浓度过高 一抗和/或二抗与组织的 非特异性结合 组织过于干燥 试剂粘附在旧的 或未制备好的玻片上 相应的措施 预实验摸索最佳浓度 一抗孵育前封闭 (最好是二抗来源的血清) 在染色过程中避免组织干燥 用新鲜制备或购买的玻片进行实验 当前第14页\共有17页\编于星期四\21点 三，细胞/组织的形态被破坏 当前第15页\共有17页\编于星期四\21点 可能的原因 抗原修复方法过于剧烈 组织切片从玻片上脱落 组织切片撕裂或褶皱,切片下有气泡 组织形态难以分辨 组织固定不充分,自发裂解 相应的措施 预实验摸索合适的修复条件 增加固定时间;烤片; 使用新鲜准备的带有充足电荷的玻片 使用锋利的刀片;分析时避开受损的区域 切片薄一些;冰冻过程形成冰晶,蔗糖脱水 及时固定;增加固定时间; 提高固定剂/组织的比例; 将组织切得较小 当前第16页\共有17页\编于星期四\21点 Vinculin,是一种细胞骨架蛋白，兼细胞黏着斑蛋白的重要成分,主要分布于细胞与细胞连接，细胞与细胞外基质黏着斑部位，通过与细胞骨架蛋白和黏着斑蛋白以及细胞骨架F肌动蛋白相互作用，在细胞粘附，伸展运动及迁