生化技术教学课件电子教案全套课件.pptx

生化技术 绪论1定义生化技术——在生物化学及其相关学科应用的各种技术，主要指生物体内物质及其代谢产物，特别是生物大分子的分离、检测、制备与改造技术。2发展过程1923Svedberg设计超速离心机1925Warberg发明微量检压仪1930放射性同位素技术在生物化学过程中应用1931Kuhn柱层析分离α、β-胡萝卜素1940电泳、层析技术50-52 气相色谱（GC）1956 Sanger x射线衍射技术确定蛋白质一级结构1953 Watson、Crick x射线衍射技术 DNA双螺旋结构1960 操纵子学说1964 人工合成胰岛素1969 固定化酶、细胞技术1973 基因工程1975 细胞工程（杂交瘤技术）**** 启动人类基因组计划**** “多莉”羊诞生?第一篇 生化分离技术第一章 生物大分子的提取与沉淀分离技术生物大分子：蛋白质、酶、核酸、多糖和脂类第一节 细胞破碎细胞破碎的原因：破碎的主要方法：机械法、物理法、化学法、酶法1 机械破碎方法1. 1高速组织捣碎机原理操作：装料，低速→高速效果：作用强烈，活性物质易受破坏1. 2匀浆器原理：效果：破碎程度较捣碎机高，破坏较少1. 3研磨器2 物理破碎2.1温度差破碎法2.2压力差破碎法2.3超声波破碎法影响因素：样品浓度、超声波频率、功率、破碎时间操作：冰浴、间歇进行适用于悬浮细胞破碎3化学破碎法原理：化学试剂改变或破坏细胞膜结构常用试剂：有机溶剂、表面活性剂4 酶学破碎法外加酶制剂或自溶法第二节 提取1 提取的基本概念与影响因素提取（抽提或萃取）：主要影响因素：a 欲提取的物质在所用的溶剂中的溶解度；b该物质向溶剂扩散的难易溶解度大小：a 溶剂：相似相溶；b 温度 c等电点2 蛋白质和酶的提取提取方法：水溶液提取、有机溶剂提取、混合提取选择方法依据：存在部位、分子结构和溶解性质2.1水溶液提取水、稀盐、稀酸、稀碱溶液常用稀盐溶液和缓冲液，应注意控制盐浓度、温度、pH 2.1.1盐浓度的选择一般用等渗盐溶液。但根据溶解度，有些蛋白质要用较高浓度盐溶液提取，而有些则用纯水提取。2.1.2 pH的选择 不在等电点附近，但不宜太高或太低。pH3~4有利于离子键分离2.1.3温度的选择一般0~10℃（常用4℃），对于耐高温的蛋白质和酶，可适当提高温度，可使杂蛋白变性分离，有利于提取和进一步纯化。2.1.4添加底物或辅酶有利于酶的提取2.2有机溶剂提取常用有机溶剂：乙醇、丙酮、丁醇等注意：蛋白质提取应根据不同蛋白质的不同性质选用不同的提取条件3 核酸的提取类化合物都溶于水而不溶于有机溶液，一般用水溶液提取。提取的一般都是核蛋白。DNA-Pro.与RNA-Pro.在不同浓度电解质溶液中溶解度有明显差别：0.14mol/L NaCl: RNA-Pro.溶解度相当大，DNA-Pro.溶解度仅为水中1％。1 mol/L NaCl: RNA-Pro.溶解度小，DNA-Pro.溶解度比水中大2倍。DNA-Pro.与RNA-Pro.在不同pH下溶解度不同RNA-Pro. PH2.0-2.5 S最小DNA-Pro. PH4.2 S最小应选择不同的条件提取分离DNA-Pro.与RNA-Pro.3.1 RNA提取细胞破碎 →水溶 →过滤去渣 →调pH5 → tRNA↓mRNA，rRNA:3.1.1 稀盐溶液提取细胞破碎 → 匀浆0.14 mol/L NaCl→RNA-Pro提取液→分离DNA-Pro、Pro、多糖RNA：tRNA15%，mRNA5%，rRNA80%3.1.2 苯酚水溶液提取细胞破碎 → 匀浆等体积90％苯酚水溶液振荡→RNA、Pro分开→RNA、多糖（水层）； DNA、Pro（苯酚层）冷酚法、热酚法，注意苯酚除杂3.2 DNA提取浓盐法：1mol/L氯化钠溶液提取，＋含少量辛醇或戊醇的氯仿一起振荡除去蛋白质 或：先用稀盐除去RNA－Pro，再用浓盐提取也可用苯酚法，苯酚层得到 DNA、Pro 第三节 沉淀分离 分离纯化：除去各种杂质，获得较高纯度物质的过程蛋白质和酶分离提纯方法：沉淀分离、层析分离、电泳分离、超离心分离等。沉淀分离：通过改变某些条件或加入某种物质，使溶液中某种溶质的溶解度降低，从而从溶液中沉淀析出的技术。包括盐析沉淀、等电点沉淀、有机溶剂沉淀、复合沉淀法、金属盐沉淀法、选择性变性沉淀等。 3.1 盐析沉淀法蛋白质在水溶液中的溶解度受盐浓度影响盐溶：盐析：?盐浓度改变蛋白质溶解度：改变蛋白质分子表面电荷，同时改变溶液中水的活度，改变水膜蛋白质溶解度与溶液中离子强度关系：lg(S/S0)= -ksIlgS=lgS0-ksI=β-ksI β为常数，取决于蛋白性质、T、pHks为盐析常数，与盐性质（离子价数、离子半径等）、蛋白结构有关ks