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分子杂交技术分子杂交 01简介核酸探针标记单链DNA探针技术简介双链DNA探针标记法末端标记DNA探针目录0305020406 07寡核苷酸探针常见的杂交RNA探针目录0908 基本信息互补的核苷酸序列通过Watson-Crick碱基配对形成稳定的杂合双链DNA分子的过程称为杂交。杂交过程是高度特异性的，可以根据所使用的探针已知序列进行特异性的靶序列检测。杂交的双方是所使用探针和要检测的核酸。该检测对象可以是克隆化的基因组DNA,也可以是细胞总DNA或总RNA。根据使用的方法被检测的核酸可以是提纯的，也可以在细胞内杂交,即细胞原位杂交。探针必须经过标记，以便示踪和检测。使用最普遍的探针标记物是同位素,但由于同位素的安全性，近年来发展了许多非同位素标记探针的方法,多使用甾类化合物地高辛配基（digoxigenin，DIG）标记。 简介 简介互补的核苷酸序列通过Watson-Crick碱基配对形成稳定的杂合双链分子DNA分子的过程称为杂交。杂交过程是高度特异性的，可以根据所使用的探针已知序列进行特异性的靶序列检测。 ? 技术简介 技术简介杂交的双方是所使用探针和要检测的核酸。该检测对象可以是克隆化的基因组DNA,也可以是细胞总DNA或总RNA。根据使用的方法被检测的核酸可以是提纯的，也可以在细胞内杂交,即细胞原位杂交。探针必须经过标记，以便示踪和检测。使用最普遍的探针标记物是同位素,但由于同位素的安全性，近年来发展了许多非同位素标记探针的方法,多使用甾类化合物地高辛配基（digoxigenin，DIG）标记。核酸分子杂交具有很高的灵敏度和高度的特异性,因而该技术在分子生物学领域中已广泛地使用于克隆基因的筛选、酶切图谱的制作、基因组中特定基因序列的定性、定量检测和疾病的诊断等方面。因而它不仅在分子生物学领域中具有广泛地应用,而且在临床诊断上的应用也日趋增多。 ? 核酸探针标记 核酸探针标记核酸探针根据核酸的性质，可分为DNA和RNA探针;根据是否使用放射性标记物的与否,可分为放射性标记探针和非放射性标记探针;根据是否存在互补链,可分为单链和双链探针;根据放射性标记物掺入情况,可分为均匀标记和末端标记探针。下面将介绍各种类型的探针及标记方法。 ? 双链DNA探针标记法 双链DNA探针标记法分子生物研究中，最常用的探针即为双链DNA探针，它广泛应用于基因的鉴定、临床诊断等方面。双链DNA探针的合成方法主要有下列两种:切口平移法和随机引物合成法。1.切口平移法(nick translation)当双链DNA分子的一条链上产生切口时,E.coli DNA聚合酶Ⅰ就可将核苷酸连接到切口的3羟基末端。同时该酶具有从5→3的核酸外切酶活性,能从切口的5端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同时又在切口的3端补上核苷酸,从而使切口沿着DNA链移动,用放射性核苷酸代替原先无放射性的核苷酸，将放射性同位素掺入到合成新链中。最合适的切口平移片段一般为50-500个核苷酸。切口平移反应受几种因素的影响: (a)产物的比活性取决于[α-32 P]dNTP的比活性和模板中核苷酸被置换的程度。(b) DNA酶Ⅰ的用量和E.coli DNA聚合酶的质量会影响产物片段的大小。(c) DNA模板中的抑制物如琼脂糖会抑制酶的活性,故应使用仔细纯化后的DNA。材料：待标记的DNA。设备：高速台式离心机，恒温水浴锅等。试剂：(1)10×切口平移缓冲液:0.5mol/L Tris·Cl (pH7.2); 0.1mol/L MgSO4 ; 10mmol/L DTT; 100μg/ml BSA。 单链DNA探针 单链DNA探针用双链探针杂交检测另一个远缘DNA时,探针序列与被检测序列间有很多错配。而两条探针互补链之间的配对却十分稳定,即形成自身的无效杂交,结果使检测效率下降。采用单链探针则可解决这一问题。单链DNA探针的合成方法主要有下列两种:(1)以M13载体衍生序列为模板,用Klenow片段合成单链探针; (2)以RNA为模板,用反转录酶合成单链cDNA探针。1.从M13载体衍生序列合成单链DNA探针合成单链DNA探针可将模板序列克隆到噬粒或M13噬菌体载体中,以此为模板,以特定的通用引物或以人工合成的寡合苷酸为引物,在[a-32P]-dNTP的存在下,由Klenow片段作用合成放射标记探针，反应完毕后得到部分双链分子。在克隆序列内或下游用限制性内切酶切割这些长短不一的产物,然后通过变性凝胶电泳(如变性聚丙烯酰胺凝胶电泳)将探针与模板分离开。双链RF型M13 DNA也可用于单链DNA的制备,选用适当的引物即可制备正链或负链单链探针。材料：已制备好的单链DNA模板（方法参见第十章中有关内容）。设备：高速台式离心机，恒温水浴锅等。试剂：(1)10×Klenow缓冲液：0.5mol/L