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酶联免疫技术第1页/共48页第2页/共48页常用的检测方法 ------微生物法1、仅适于抗生素总残留的检测，目前在牛 奶的抗生素检测中占据一定市场．2、优点：为成本较低、检测速度较快;3、缺点：不能区分具体的抗生素药物，灵 敏度和特异性相对较低．第3页/共48页常用的检测方法 ----物理化学法1、如液相色谱(HPLC) 、气相色谱(GLC) 、质谱 (MS) 、薄层色谱法(TLC) 等，可用于鉴定和 定量。2、优点：分离度好、专属性强，常常可以同时测 定几种药物。3、缺点：需要专门仪器和熟练技术的分析人员，而且需要复杂的样品前处理和高纯度的化学试剂。由于样本前处理设备多、测定操作烦琐和费用高，在基层实验室推广和使用受到限制。因而检测大批样本较为困难。第4页/共48页 常用的检测方法 -----生物芯片法1、生物芯片（biochip）是指采用光导原位合成或微量点样等方法，将大量抗原等有序地固化于支持物（如玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝胶、尼龙膜等载体）的表面，组成密集二维分子排列，然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交，通过特定的仪器，比如激光共聚焦扫描或电荷偶联摄影像机（CCD）对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析，从而判断样品中靶分子的数量.2、主要特点是高通量、微型化和自动化 ，因涉及技术和仪器问题，目前还不能普及应用．第5页/共48页常用的检测方法 -----酶联免疫测定法1、将抗原与抗体反应和酶化学反应结合到一起的 测定技术，近年来已研发出多种ELISA检测试 剂盒用于检测动物组织中的药物残留。2、具有灵敏度高、快速、特异性强的特点，所需 仪器化程度低和样本前处理相对简单，特别适 于现场监控和大量样本筛查。3、现用于兽药残留检测的试剂盒，如国外德国 R-Biopharm，国内深圳绿诗源、北京望尔等。第6页/共48页1.　ELISA的原理2.　ELISA的类型3.　试剂准备：免疫吸附剂 结合物 酶底物的准备 4.　对照设定5.　标本的采取和保存6.　结果判断 第7页/共48页1.　ELISA的原理 ELISA是一种免疫测定（immunoassay，IA）。基础:抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记，加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。---利用抗原抗体的特异性反应作为识别手段，用酶催化底 物等方法作为显示系统，用微孔板等材料作为载体和分 离系统的一种生物学检测方法。---结合物与相应的抗原（抗体）反应后，结合的酶仍能催 化底物生成有色物质，而颜色的深浅可定量待测物的含 量。第8页/共48页酶免疫测定类型 酶免疫组化酶免疫技术均相酶免疫测定酶免疫测定固相酶免疫测定非均相酶免疫测定液相酶免疫测定这种固相酶免疫测定方法在1971年最初建立时称为酶联免疫吸附剂测定（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay），简称ELISA。第9页/共48页1.1　抗原抗体反应 1.1.1　可逆性 抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡，其反应式为：Ag+Ab→Ag·Ab　 抗体的亲和力（affinity），可以用平衡常数K表示：K=[Ag·Ab]／[Ag][Ab] ,Ag·Ab的解离程度与K值有关。高亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构型上非常适合，两者结合牢固，不易解离。解离后的抗原或抗体均能保持原有的结构和活性。第10页/共48页1.1.2　特异性 抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结合位点之间。化学结构和空间构型互补关系，具有高度的特异性。 测定某一特定的物质，而不需先分离待检物。第11页/共48页1.1.3　最适比例 第12页/共48页1.1.4　敏感性化学比色法的敏感度为mg/ml水平酶反应测定法的敏感度约为5-10μg/ml免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相仿标记的免疫敏感度可提高数千倍，达ng/ml水平例如，HBsAg，其敏感度可达0.1ng/ml。第13页/共48页1.4　免疫测定在临床检验中的应用由于各种抗原成份，包括小分子的半抗原，均可用以制备特异性的抗血清或单克隆抗体，利用此抗体作为试剂就可检测标本中相应的抗原，因此免疫测定的应用范围极广。第14页/共48页ELISA的类型一、双抗体夹心法：测抗原 （成正比） 双抗原夹心法：测抗体（成正比）二、间接法：检测抗体常用的方法。 （成正比） 三、竞争法：测抗体 （成反比） 竞争法：测抗原 （成反比）　 小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。小分子