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感受态和提取质粒精美生物医学;;一、感受态的制备;2. 感受态细胞的概念
感受态细胞(Competent cells):
受体细胞经过一些特殊方法(如:CaCl2,RbCl等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生变化,成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的状态,成为感受态 。
;;4、 感受态细胞的制备步骤
挑单个菌落接种到20 ml LB培养基中,37℃剧烈振荡过夜。
取1ml过夜培养物, 接种到25ml LB培养基中, 37℃振荡培养1-2小时,直至培养夜中细菌浓度达到OD600为0.2-0.4(细菌对数期生长)。或取1ml甘油菌,接种到100ml LB培养基中, 37℃振荡培养1-2小时。(共接两瓶)
培养物冰上放置10min ,4000rpm, 4℃离心10分钟,收集菌体。
;将菌体悬浮于5 ml预冷的CaCl2 中, 冰上放置20分钟。
4000rpm, 4℃,离心10分钟,弃上清,然后将细菌轻轻悬浮在2 ml CaCl2 中,0-4 ℃ 保存24至48小时。
或缓慢滴入甘油(灭菌)至浓度为15%,轻柔混匀,将细菌分装成0.2ml/每管,干冰上放置1小时,转入-80℃冰箱储存。
;制备感受态细胞的注意事项;3 .一定时间内使用;;J-30I;用 途;操作步骤;2
关好离心机盖,设定离心机转子型号、转速、离心时间、温度、启动运转。
;3
离心时间到待转速降至零,打开离心机盖将样品(离心管)取出,用柔软干净的布擦净转头和机腔内壁,待离心机腔内温度与室温平衡后方可盖上机盖。
;注意事项;注意事项;维护和保养;二、提取质粒; 2、原理 ;;3、实验材料、器具及药品 ;实验药品
1.LB培养基配制及分装(每升用量)
胰蛋白胨(Bacto-tryptone) 10g
酵母提取物(Bacto-yeast extract) 5g
NaCl 10g
pH 7.5
121℃,20min 高压灭菌 ;2.溶液
溶液Ⅰ 200ml
50mmol/L 葡萄糖 1.98g
25mmol/L Tris-Cl(pH 8.0) 5ml 1M
10mmol/L EDTA(pH 8.0) 5ml 0.4M ;;NaOH:最佳的溶解细胞的试剂,不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞,碰到了碱后几乎在瞬间就会溶解。
SDS:呈碱性,但如果只用SDS,达不到彻底溶解细胞的作用,加入SDS主要为下一步做铺垫。
SDS在高盐浓度下发生沉淀,同时与蛋白质结合,所以沉淀也将溶液中的大部分蛋白质沉淀下来。
;;;;3.分离液
酚/氯仿/异戊醇=25:24:1
酚:使蛋白质变性,作用大于氯仿。
氯仿:增加比重,使得酚/氯仿始终在下
层,方便水相的回收,跑到水相中
的酚会少得多。
异戊醇:主要可以使离心后上下层的界面
更加清晰,方便水相的回收。;;4、实验步骤;?
加入150uL溶液III(轻轻混匀),冰上静置15min质粒DNA复性
?
12000rpm,离心15min,取上清记录体积到一新管
?
上清加等体积的酚:氯仿:异戊醇(振荡混匀)
?
12000rpm,离心15min,取上清记录体积到一新管
?
(可省略)上清加等体积的氯仿:异戊醇(振荡混匀)
?
12000rpm,离心15min,取上清记录体积到一新管
?
上清加2倍体积的无水乙醇(充分混匀),冰浴 30min
?;12000rpm,离心15min
?
沉淀用75%乙醇1mL洗涤两次(振荡混匀、离心)
?
12000rpm,离心10min
?
沉淀超净台中风干
?
沉淀用20uL RTE溶解,-200C保存; 质粒的检测——凝胶电泳;感谢观看!
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