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实验琥珀酸脱氢酶第1页/共19页 了解琥珀酸脱氢酶的作用及 酶促反应中的竞争性抑制作用实 验 目 的第1页/共18页第2页/共19页 竞争性抑制作用抑制剂和底物的结构相似，能和酶的底物分子竞争与酶的活性中心相结合，从而阻碍酶与底物结合形成中间产物。酶活性位点第2页/共18页第3页/共19页 抑制程度取决于抑制剂和底物对酶的相对亲和力 以及抑制剂和底物浓度比。加大底物浓度可减弱甚至解除抑制作用。第3页/共18页第4页/共19页 实 验 原 理延胡索酸琥珀酸还原型甲烯蓝(白)琥珀酸脱氢酶甲烯蓝(蓝)E + S ES E + P琥珀酸丙二酸E+IEI琥珀酸脱氢酶FAD FADH2第4页/共18页第5页/共19页 操 作 步 骤 1、酶提取液的制备　 1~1.3 g 兔肌肉(剪碎)＋海砂少许(1/3匙)　 +2ml 磷酸盐缓冲液(1/15 mol/L)，研磨成糊状， 然后再加10ml 磷酸盐缓冲液(1/15 mol/L)混匀。2、纱布过滤（双层）3、取小试管五只，按书上P40表格加入各试剂。 最后加石蜡隔绝空气，37℃水浴保温。 每间隔10~15min观察一次结果，并记录。第5页/共18页第6页/共19页 实 验 结 果编号12345酶有有有有无底物+++++++++++++抑制剂-+++++++-结果第6页/共18页第7页/共19页 第7页/共18页第8页/共19页 注 意 事 项注意区分肌肉与筋膜；家兔肌肉必须充分剪碎碾磨，海砂不可加太多；12 ml缓冲液要分次加入，不可一次性加入；碾磨器械、纱布要及时清洗，纱布要洗干净晾干；滴加试剂时，一定要看清试剂的名称和浓度；滴加液体石蜡时沿着管壁倾斜加入，盖住液面即可；观察结果时不能振摇试管，避免甲烯白重新氧化变蓝；实验完成后试管要用皂粉清洗。第8页/共18页第9页/共19页 改良Mohum法测定鼠肝谷-丙转氨酶(GPT)活性实 验 22第9页/共18页第10页/共19页 实 验 目 的 掌握GPT活性测定的基本原理熟悉GPT活性测定的具体操作方法了解血清GPT活性测定的临床意义第10页/共18页第11页/共19页 实 验 原 理GPT2,4-二硝基苯丙氨酸丙酮酸?-酮戊二酸谷氨酸在520nm波长测定其光密度，与已知浓度的丙酮酸溶液比较，即可计算谷-丙转氨酶的活性丙酮酸二硝基苯（碱性溶液中呈棕色）第11页/共18页第12页/共19页 血清谷-丙转氨酶活性单位在pH 7.4、37℃条件下，每毫升肝匀浆与底物保温30min后，每生成2.5 ?g的丙酮酸作为1个谷-丙转氨酶的活性单位，血清中GPT正常值为2-40 U/mL。第12页/共18页第13页/共19页 实 验 步 骤标准管法测定酶活性：1、取干燥试管4支，标号 测定管 对照管 标准管 空白管2、依次加入试剂，混匀，37℃保温3、呈色反应后，520nm比色测OD值第13页/共18页第14页/共19页 谷丙转氨酶活性单位/mL鼠肝匀浆 = ? U/ml 方法一：以空白管调0，测A测定、A标准、A对照实 验 结 果 A测定测定管中生成丙酮酸的质量 = ——— × m标准 A标准 A对照对照管中生成丙酮酸的质量 = ——— × m标准 A标准30min中生成丙酮酸的质量 = m测定 – m对照 A测定-A对照 = ————— × m标准 A标准 30min生成丙酮酸的质量 1活性单位 = ———————————— · —— 2.5 ?g