基因工程药物之干扰素的制备流程讲座.pptVIP

基因工程药物 --干扰素的制备 ;1 什么是干扰素;1.1天然干扰素的分类; 提高单核巨噬细胞、树突状细胞的抗原提呈能力 增强Tc细胞和NK细胞的杀伤活性 抑制TH2细胞形成，下调体液免疫应答 趋化作用 抗病毒和抗肿瘤作用（次要） 2. 根据动物来源确定分类 人干扰素（HuIFN），小鼠干扰素（MuIFN）。;;1.2 重组干扰素的临床应用;2 基因工程大肠杆菌发酵生产工艺;干扰素生产工艺路线;目的基因的分离;一、目的基因的分离与扩增;二、构建重组质粒;三、重组体引入宿主细胞;四、受体菌的筛选;五、分析保存;干扰素的发酵工艺过程;1．菌种培养 取－70℃下保存的甘油管菌种（工作种子批），于室温下融化。然后，接入摇瓶，培养温度30℃，pH7.0，250 r/min活化培养18±2小时后，进行吸光值测定和发酵液杂菌检查。 2．种子罐培养 将已活化的菌种接入装有30L培养基的种子罐中，接种量10%，培养温度30℃，pH7.0，级联调节通气量和搅拌转速，控制溶解氧为30%，培养3～4小时，转入发酵罐中，同时取样发酵液进行显微镜检查和LB培养基划线检查，控制杂菌 ;3.发酵罐培养 将种子液通入300L培养基的发酵罐中，接种量10%，培养温度30℃，pH7.0。级联调节通气量和搅拌转速，控制溶解氧30%，培养4小时。然后控制培养温度20℃，pH6.0，溶解氧60%，继续培养5～6.5小时。同时进行发酵液杂菌检查，当OD值达9.0±1.0后，用5℃冷却水快速降温至15℃以下，以减缓细胞衰老。或者将发酵液转入收集罐中，加入冰块使温度迅速降至10℃以下。 4. 菌体收集 将已降温的发酵液转入连续流离心机，16000 r/min离心收集。进行干扰素含量、菌体蛋白含量、菌体干燥失重、质粒结构一致性、质粒稳定性等项目的检测。菌体于－20℃冰柜中保存时，不得超过12个月。每保存3个月，检查一次活性。 ;3. 干扰素的分离纯化工艺过程;3.1 干扰素分离工艺过程;(1)菌体裂解;(2)预处理-沉淀;(3)离心;（4）初级分离;3. 2、干扰素纯化工艺过程;(1) 溶解粗干扰素;(2) 沉淀与疏水层析;等电点沉淀（2）：磷酸调节pH4.5，调节电导???40 ms/cm，2℃～10℃，静置过夜 超滤：1000 ku超滤膜过滤，除去大蛋白。 透析除盐：调整溶液pH 8.0，电导值，10 ku超滤膜，0.005 M缓冲液。 ;(3)无菌过滤分装;(4)检测项目;半成品检定;（5）相对分子量测定 还原型SDS，加样量不地域微克，同时用已知相对分子量的蛋白标准系列做对照，以迁移率为横坐标，相对分子量的对数为纵坐标作图，计算相对分子量。与理论值比较，误差不得高于10%。 （6）残余外源性DNA含量测定 用放射性核素或生物素探针法测定，每剂量中残余外源性DNA应低于100pg。 （7）残余血清IgG含量测定 在应用抗体亲和层析法作为纯化方法时必须进行此项检定。 （8）残余抗生素活性测定 半成品中不应有抗生素活性存在。 ; （9）紫外光谱扫描 检查半成品的光谱吸收值，最大吸收值应在280±2纳米。 （10）肽图测定 用CNBr裂解法，测定结果应符合干扰素的结构，且批与批之间应一致。 （11）等电点测定 等电聚焦电泳。 （12）除菌半成品应做干扰素效价测定、无菌试验和热源质试验。;成品检定;（5）热原质试验 同半成品检定。 （6）干扰素效价测定 同半成品检定，效价不应低于标示量。 （7）安全试验 取体重为350-400克豚鼠3只，每只腹侧皮下注射量为成人每千克体重临床使用最大量的3倍，观察7天，若豚鼠局部无红肿、坏死、总体重不下降，说明成品合格。 取体重18-20克小鼠5只，每只尾静脉注射剂量按人每千克体重临床使用最大量的3倍，观察7天，若动物全部存活，说明成品合格。;4 国内基因工程药物产业发展状况;存在的问题：（1）同种产品生产厂家过多，造成市场恶性竞争， 严重影响产业的健康发展。（2）融资渠道单一、产业发展资金不足。（3）医药市场竞争无序，行业不正之风严重。（4）企业管理相对滞后，技术兼经营型人才匮乏。;谢谢！;四川石化乙二醇装置;乙二醇装置第二周工作总结;乙二醇装置第二周工作计划;2011-07-10;乙二醇反应;浓缩及脱水;MEG精制;MEG回收;DEG吸收;TEG吸收;环氧乙烷化学性质及用途;