核酸分子杂交与应用.pptxVIP

核酸分子杂交与应用第1页/共86页 19 五月 20232核酸分子杂交：来源相同或不同的DNA甚至DNA与RNA分子变性后，在合适的条件下通过碱基互补形成双链杂交体的过程称核酸分子杂交(molecular hybridization)。核酸分子杂交技术是目前生物化学和分子生物学研究中应用最广泛的技术之一，也是临床分子检验的重要技术。第2页/共86页 19 五月 20233第3页/共86页 19 五月 20234核酸探针的标记探针(probe)是指用放射性核素或其它标记物标记的核酸片段。标记物放射性标记非放射性标记生物素标记地高辛标记荧光素标记第4页/共86页 19 五月 20235探针的种类DNA探针：双链或单链DNA探针是最常用的核酸探针。长度在几百碱基对以上。DNA探针又分为：基因组DNA探针：有细菌、病毒、原虫、真菌、动物和人类细胞DNA探针，多为某一基因的全部或部分序列，或某一非编码序列。cDNA探针：以mRNA为模板经过逆转录酶催化产生的互补于mRNA的DNA链。第5页/共86页 19 五月 20236探针的种类DNA探针优点：1、一般克隆在质粒载体中，可以无限繁殖；2、DNA探针不易降解3、DNA的标记方法比较成熟。第6页/共86页 19 五月 20237探针的种类RNA探针：可以是标记分离的RNA，也可以是重组质粒在RNA聚合酶作用下的转录产物。其优点是：RNA探针为单链，复杂性低，与靶序列杂交反应效率极高因不存在重复序列，因此特异性高本底低缺点：第7页/共86页 19 五月 20238探针的种类寡核苷酸(oligo)探针：由17～50mer组成的短探针。优点：可根据需要人工合成相应的序列；因片段短，只有一个核苷酸突变，其Tm值也有明显变化，特别适用于点突变的检测杂交速度快特异性强缺点：所带标记物少灵敏度低；片段短杂交体不稳定第8页/共86页 19 五月 20239探针的标记切口平移法标记原理：是目前实验室是最常用的一种脱氧核糖核酸探针标记法。利用大肠杆菌DNA聚合酶1的多种酶促活性将标记的dNTP掺入新合成DNA链中使探针被标记。 带缺口(nick)的线状、超螺旋及环状双链DNA均可作为切口平移法的模板。第9页/共86页 19 五月 202310DNase IDNA Pol I,α-32P-dNTP第10页/共86页 19 五月 202311第11页/共86页 19 五月 202312标记步骤1、取1μgDNA溶于少量无菌蒸馏水中2、加入μl10x切口平移缓冲液，混匀 10x切口平移缓冲液 0.5mol/L Tris.Cl(pH7.2) 0.1mol/L MgSO4 1mmol/L 二硫苏糖醇(DTT) 500μg/ml 牛血清白蛋白第12页/共86页 19 五月 202313标记步骤3、加入除标记核苷酸外的其他三种脱氧核糖核苷酸溶液(也可以是多种标记核苷酸)，20mmol/L溶液各1μl。 以下操作要在同位素工作室中有防护措施的情况下进行操作4、加入100μCi(10μl)标记的核苷酸溶液。注：应贮存在－20oC冰箱中，使用前在室温下放置15～30分钟融化。要尽量减少冻融次数。第13页/共86页 19 五月 202314标记步骤5、加入无菌蒸馏水，至终体积为46.5μl，混匀6、加入0.5μl稀释的DNase I溶液，混匀7、加入1μl(5U)DNA聚合酶I溶液，混匀 注：以上操作均在冰浴中进行8、置14～16oC水浴中保温1～2小时9、加入2μl 0.5mol/L EDTA终止反应10、纯化标记的DNA探针第14页/共86页 19 五月 202315单链DNA探针的标记第15页/共86页 19 五月 202316探针的标记随机引物法标记原理：随机引物是含有各种可能排列的寡聚核苷酸片段的混合物，可以与任何核酸序列杂交，起到聚合酶促反应的引物作用。将待标记的探针模板与随机引物一起退火，合成标记探针。第16页/共86页 19 五月 202317第17页/共86页 19 五月 202318标记步骤1、冰浴中，在一微量离心管内顺序加入下列溶液，并混匀 20mmol/L DTT 1μl 5mmol/L dATP、dGTP、dTTP 1μl 10x随机引物缓冲液 1μl 标记dCTP 3