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分析生物学讲义基因克隆技术;克隆(clone)——无性繁殖 基因克隆——DNA的无性繁殖，永远保存和复制 基因克隆（分子克隆molecular cloning） 通过体外重组技术,将一段目的DNA经切割、连接插入适当载体，并导入受体细胞，扩增形成大量子代分子的过程。 基因克隆的核心---体外重组(Recombination) 人工将一段目的DNA插入一个载体的过程。;一、 DNA重组技术;DNA重组技术;;（1）直接从生物体中提取总DNA，构建基因组DNA文库(genomic DNA library)，从中调用目的基因； （2）以mRNA为模板，反转录合成互补的DNA片段，建立cDNA文库； （3）利用聚合酶链式反应（PCR）特异性地扩增所需要的目的基因片段。 （4）化学合成;（1）基因组文库的构建;;（2） 反转录人工合成互补DNA, cDNA文库;2. 构建重组DNA;（1）限制性内切酶——分子手术刀;根据分离此酶微生物的学名，一般取3个字母。 第一个字母大写 该微生物属名前的第一个字母 第二、三个字母小写 该微生物种名前的2个字母 第四个字母大写 有变种或品系的第一个字母 罗马字母Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 从一种微生物中发现了几种限 制酶，按发现顺序排列 如EcoRⅠ是指从大肠杆菌（Escherichia coli）R株分离得到的第一种限制酶。; 分子刀-DNA限制性内切酶;;（2）DNA连接酶;（3）载体（vector）;克隆片段的大小（克隆能力） (1)1kb —— M13 (2)10kb —— plasmid (3)22kb —— λphage (4)50kb —— casmid由噬菌体DNA和质粒DNA的某些功能 片段拼接而成 (5)0.1-0.4Mb —— BAC细菌人工染色体 (6)0.5-2Mb —— YAC 由酵母基因和PBR322质粒衍生物构成; ;重组DNA的操作;3.导入受体细胞;a.低渗CaCl2溶液在低温（0℃）时处理快速生长的细菌，细菌细胞膨胀成球形，处于感受态; b.转化混合物中的DNA分子在此条件下易形成抗DNA酶的羟基－钙磷酸复合物粘附在细菌表面; C.重组DNA在42℃短时间热激后吸附在细胞表面，在丰富培养基中生长数小时后，球状细胞恢复原状并繁殖。;;4.rDNA的筛选鉴定;蓝白斑筛选 α-互补（α-complementation）： 在T-vector或 PUC质粒序列中，插入了lac启动子-操纵子基因序列以及编码β-半乳糖苷酶N-端145个氨基酸的核苷酸序列（又称α-肽）； 这类载体对应的宿主菌（如JM、DH5α系列）β-半乳糖苷酶基因失去了编码α-肽碱基序列 只有当这类载体引入到宿主菌后，互补产生有活性的β-半乳糖苷酶。; 若在多克隆位点插入外源基因，将使lac Z基因片段灭活，不能产生α-互补现象，不能生成蓝色菌落，而保持白色。;第26页/共40页;一是从基因产物追溯到基因， 二是分离突变体，把正常的和突变的进行比较，找出有差异的DNA或RNA。然后，分别以正常DNA和变异的DNA（也可能是有无）进行功能验证，证明这段DNA确实控制这个性状，那么这个基因的分离就完成了。; 过去分离基因主要是根据基因的产物，蛋白质和mRNA，追溯、返推到基因，但是编码产物清楚又有足够表达量的基因人们知道的还很少，因此基本上都已克隆过了。而需要去克隆的重要基因几乎都不知道其编码产物。因此，分离目标性状的特异的突变体，通过对突变基因进行精细定位，进而对该基因进行图位克隆，或根据突变体的差异表达，利用DDRT-PCR、SSH、mRNA-AFLP等技术把特异性表达产物扩增、放大，达到可以检测的水平，直接把目标基因克隆，已成为近代基因克隆的两条主要途径。。;基因克隆方法的选择;类型II未知目的基因序列（1）差异表达序列，即目的基因表达具有组织、器官等时空差异性。可以采用随机引物多态性扩增技术，mRNA差别显示技术（DDRT-PCR）和差示分析法（RAD）等进行克隆。（2）无差异表达的目的基因，可采用文库筛选法、功能蛋白分离法即直接测序法等进行，是难度较大较繁琐的策略。;类型III无基因序列及表达功能信息，但具有基因遗传图，转座子标签等条件，常用图位克隆和转座子标签法克隆。 ;1.RACE技术;分为5-和3-RACE两种。 3-RACE根据一般基因具有polyA尾巴的特点，首先将mRNA或总RNA用PolyT引物反转录，再用特异引物（GSPs）和PolyT引物PCR即可。 5-RACE相