双向电泳原理及实验步骤.pptxVIP

双向电泳原理及实验步骤;1994年，澳大利亚Macquarie大学的Wilkins和Williams首先提出了蛋白质组（Proteome）的概念，其定义为在一种细胞内存在的全部蛋白质。 蛋白质组研究中主要应用的技术包括：双相电泳(2-DE)、新型质谱(MS)技术、数据库设置与检索系统等。 ;蛋白质组分析的首要要求;生物学问题的提出;蛋白质组研究的基本技术路线;一、双向电泳的实验原理;;一维固相pH梯度等电聚焦（IEF with IPG）： ;;样品制备基本原则;样品制备;可溶性样品 ;双向电泳样品的溶解;增加样品溶解性的手段;两性载体电解质：即便在离液剂和去垢剂存在的情况下，某些蛋白质也需要在盐离子的作用下才能保持其处于溶解状态，否则这些蛋白质在其处于PI点时会发生沉淀。 两性载体电解质的作用在于补充样品中少量的盐分，从而保证蛋白质的溶解性。应用时，两性电解质的浓度应小于0.2％（w/v)。浓度过高会使IEF的升压困难、速度降低。另外，为了保证实验的精确性，在选择不同pH范围的IPG胶条时，也应使两性电解质的pH值与之相符合。;样品上样缓冲液;胶条蛋白载样量;IPG胶条蛋白质大约载样量;蛋白质样品的上样量;等电聚焦中pH梯度的选择;ReadyStrip IPG Strip pH Ranges;Broad Range Separations;More Data with Narrow Range IEF;聚焦时间的优化;IEF的基本条件;两维间的平衡;二维SDS;Second Dimension SDS;聚丙烯酰胺凝胶和转印到膜上的蛋白质的检测;适用于质谱的染色方法;考马斯亮蓝染色;银染;荧光染料;凝胶的图像处理分析;综合的数据管理;;PDQuest Work Flow; 样品制备（Sample preparation） 固相预制胶条的水化（IPG strip rehydration） 第一向等电聚焦（IEF） 胶条的平衡（IPG strip equilibration） 第二向SDS电泳（SDSelectrophresis） 凝胶的染色及检测（Detection/Staining） PDQuest软件分析（Software analysis） 质谱鉴定（Protein identification） ;最高电压10,000 V 10?–25?C 温度控制 7, 11, 17, 18, 和 24 cm的聚焦盘，可以各放12根胶条 可以储存10个程序，每个程序有10步 程序可进行时时编辑 可供选配的打印机;等电聚焦的操作;第41页/共61页;等电聚焦的操作;第43页/共61页;等电聚焦的操作;第45页/共61页;等电聚焦程序的设置;配制SDS凝胶;胶条的??衡;胶条的转移 ;第50页/共61页;第51页/共61页;胶条的转移 ;第53页/共61页;胶条的转移 ;第55页/共61页;SDS电泳;凝胶的染色;Bio-Safe 染色法;图像扫描及软件分析;;谢谢观看！