抑菌试验预习方案.doc

抑菌试验 1 定义 抑菌试验，用于测定抗菌药物体外抑制细菌生长效力的试验称为抑菌试验 抑菌活性的研究实验方案。 实验方法 1. 纸片法（抑菌圈法） 将测定菌株接种到培养基中，置37度条件下培养6-24小时，取出备用。再用无菌吸管吸取上述培养液0.1ml，再用三角刮刀将菌液涂匀。待培养基表面稍干后，用无菌小镊子分别取出所需的药敏纸片均匀地贴在培养基的表面，轻轻压平，各纸片间应有一定距离，并分别做上标记。将培养皿置37度恒温箱内培养18-24小时后，测量各种药敏纸片抑菌圈直径的大小。 2. 挖孔法 （1） 在平板上打孔，然后将药液滴入孔内，用经酒精灯灭菌的接种环挑取适量细菌培 养物，以划线方式将细菌涂布到平皿培养基上。具体方式：用灭菌接种环取适量细菌分别在平皿边缘相对四点涂菌，以每点开始划线涂菌至平皿的1/2，依次划线，自至细菌均匀密布于平皿（将测定菌株接种到培养皿中，置37度条件下培养18-24小时，用灭菌的棉拭子将带将细菌混悬液涂布于平皿培养基表面。要求涂布均匀）。 （2） 以无菌操作将灭菌的不锈钢小管，（外径4mm，孔径与孔距均为3mm，管的两 端要光滑，也可用玻璃管和瓷管），放置在培养基上打孔，将孔中的培养基用针头挑出，并以火焰封底，使培养基能充分的与平皿融合 （3） 加样时，按不同药液加样，用无菌滴管将样品加至满而不溢为止。 3. 牛津杯法 （1） 双碟的制备方法：将灭菌培养基溶化后取15ml倒入灭菌平皿内。吸取待测菌株的菌液1-5ml与100ml冷至45度的培养基混匀，然后分别每一平皿加入5ml。并均匀摊布在具有底层培养基的平皿内。 （2） 待培养基凝固后，在每碟中均匀立放小钢管（及牛津杯）4个，用陶瓦盖覆盖。 （3） 将下列实验药液分别加入小钢管中，置37度培养18-24小时，量取抑菌圈大小，判定抗菌药物抑菌作用的强弱。 乳酸菌的抑菌实验 1产抑菌活性物质乳酸菌的初筛 采用纸片法。将培养好的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌培养液 OD 600分别调整到 0.17、0.19、0.10，各取 100μL 接种于 LB 固体培养基，涂布均匀，固定1h。加入灭菌滤纸圆片。取过滤灭菌的培养上清液 50μL 滴加到滤纸圆片上。平板于37℃培养 12h。测量抑菌圈直径，每个菌株做三个平行实验，求均值。挑选出纸片周围具有较大抑菌圈及发酵产物具有广谱抗性的菌株进行下一步试验。 2产抑菌活性物质乳酸菌的复筛-牛津杯法 在培养皿中加25mL LB固体培养基，凝固后，分别吸取0.2mL指示菌稀释液于固体培养基中，用灭菌推棒涂抹均匀，在每个平皿中等距离放置牛津杯4个，每个牛津杯中加入200μL初筛出的乳酸菌上清液，于37℃培养12h。若在牛津杯周围出现抑菌圈，则表明该乳酸菌具有抑菌活性，并用游标卡尺测量抑菌圈直径，每个菌株做三个平行实验，求均值。 抑菌物质的确定 1酸抑制作用的排除 用乳酸和盐酸分别调蒸馏水、MRS液体的pH值分别为3.0、4.0、4.5、5.0、6.0，做各种指示菌的抑菌实验，确定对照pH值。挑取发酵产物对5种指示菌都有抑菌作用的菌株，接种于1mLMRS液体，30℃静置培养24h，再取100μL到10mL MRS液体，30℃静置培养48h，1×104r/min离心1min后，测其pH值，并用1mol/L NaOH和1mol/L HCl将其离心发酵上清液调至对照pH值，做对各种指示菌的抑菌实验。 2过氧化氢作用的排除 过氧化氢酶溶解在50mmol /L 的磷酸缓冲液( pH=7.0 )中配成母液,加入到发酵液中使过氧化氢酶的终浓度为5mg/mL,在37℃水浴中温育2h后取出,检测过氧化氢酶处理后发酵液的抑菌活性。 3蛋白酶解检测 用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶对筛选出的菌株进行酶分解实验，先用1mol/LNaOH和1mol/LHCl分别调发酵液到胰蛋白酶、木瓜蛋白酶的最适作用pH7.0，按1mg/mL加入胰蛋白酶、木瓜蛋白酶，37℃水浴2h，再将pH值调回6.5（对照pH值），做对各种指示菌的抑菌实验。 产细菌素乳酸菌的鉴定 通过rep-pcr已经将菌种进行种水平的鉴定，将重复的菌进行从大到小的范围缩小，方便细菌素菌株的鉴定。 生长曲线的测定 本实验用分光光度计对已经鉴定产细菌素的细菌进行光电比浊测定不同培养时间细菌悬浮液的OD值，绘制生长曲线 (l)标记:取无菌大试管,用记号笔分别标明培养时间; (2)接种: (3)培养:将己接种的试管置摇床37e培养，分别培养相应时间后取出放入冰箱中贮存； (4)比浊测定:用未接种的MRS液体培养基作空白对照，选用6O0nm波长测定吸光值，同时测定pH值。记录。 三、试验方法 （一）平板抑菌试验（真菌） 将丝瓜伤流液过滤除菌，定量加在PDA培养基中配制成平板，对照组分别在培养基中加入域丝瓜伤