DB15T 2188—2021农杆菌介导油菜黑胫病菌（Leptosphaeria biglobosa）遗传转化技术规程.pdfVIP

ICS 65.020.20 CCS B16 15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 2188—2021 农杆菌介导油菜黑胫病菌（Leptosphaeria biglobosa）遗传转化技术规程 Technical code of practice for Agrobacterium tumefaciens-Mediated Transformation in Leptosphaeria biglobosa 2021-05-25 发布 2021-06-25 实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发 布 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020 《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由内蒙古自治区农牧厅提出。 本文件由内蒙古自治区农业标准化技术委员会（SAM/TC 20）归口。 本文件起草单位：内蒙古自治区农牧业科学院、内蒙古自治区农牧业信息中心。 本文件主要起草人：宋培玲、李子钦、史志丹、贾晓清、皇甫海燕、燕孟娇、杨永青、郝丽芬、郭 晨、皇甫九茹、罗军。 农杆菌介导油菜黑胫病菌（Leptosphaeria biglobosa）遗传转化技 术规程 1 范围 本文件规定了农杆菌介导油菜黑胫病菌（L. biglobosa）的遗传转化技术参数。 本文件适用于油菜黑胫病菌（L. biglobosa）的遗传转化。 2 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件。 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 油菜黑胫病 phoma stem canker 由小球腔菌属弱致病性病原菌（Leptosphaeria biglobosa）引起的系统性侵染病害，主要危害油 菜茎上部，染病茎秆，病斑早期呈灰色，有黑色边界，茎秆干枯时病斑呈灰白色，有时肉眼可见小黑点， 即无性生殖世代( Phoma lingam) 子实体－分生孢子器。 3.2 农杆菌介导遗传转化 agrobacterium tumefaciens-mediated transformation 农杆菌介导遗传转化（ATMT）是一种依据农杆菌能够侵染植物的特点将外源基因导入植物基因组中 使目的基因表达的方法。 4 仪器和用具 4.1 仪器 电子天平、超净工作台、生物显微镜、荧光显微镜、离心机、摇床、纯水仪、生化培养箱、冰箱、 高压灭菌锅、液氮罐、凝胶成像系统、PCR仪。 4.2 用具 烧杯、、三角瓶、量筒、酒精灯、镊子、血球计数板、接种针、载玻片、盖玻片、移液器、吸头、 离心管、培养皿、纱布、漏斗。 5 试剂和培养基 5.1 试剂 乙酰丁香酮（AS）、2-吗啉乙磺酸（MES）、潮霉素（Hyg）、卡那霉素（Kan）、利福平（Rif）、 头孢噻肟钠（Cef）、葡萄糖、酵母粉、胰蛋白胨、琼脂粉、NaCl、K HPO 、KH PO 、MgSO ·7H O、(NH) SO 、 2 4 2 4 4 2 4 2 4 CaCl ·H O、FeSO ·7H O、DNA提取试剂盒、琼脂糖、Taq酶、PCR引物、DL2000 DNA Marker。 2 2 4 2 5.2 培养基类型 马铃薯培养基（PDA）、牛肉膏蛋白胨培养基（LB）、共培养培养基（CM）、诱导培养基（IM）、 筛选培养基（SM）。 6 遗传转化方法 6.1 用于筛选阳性转化子的潮霉素浓度 用孔径为5 mm的打孔器打取黑胫病菌菌饼，接种于含有潮霉素质量浓度梯度为 0 μg/mL、25 μg/mL、 50 μg/mL、100 μg/mL、150 μg/mL、200 μg/mL 的PDA平板上，于25 ℃下培养7