基因工程常规技术核酸提取纯化.pptVIP

* 第三十页，共七十一页，2022年，8月28日 一些RNA分子，特别是mRNA，会在苯酚处理过程中被除去，但是绝大多数的RNA都和DNA一起保留在水溶液中。 最有效的除去RNA的方法： 使用核糖核酸酶，它能够迅速降解RNA分子，把它们变成单核苷酸 * 第三十一页，共七十一页，2022年，8月28日 常用：无水乙醇、异丙醇 乙醇沉淀法的额外优点是将短链和单体核酸成分留在了溶液中。核糖核酸酶处理产生的核苷酸因此在这一步得到了去除。 （3）沉淀DNA * 第三十二页，共七十一页，2022年，8月28日 * 第三十三页，共七十一页，2022年，8月28日 * 第三十四页，共七十一页，2022年，8月28日 一般过程及原理： 动物组织剪成小块，匀浆或置液氮中冻结后研磨成细粉末。 组织培养的细胞用胰酶消化松散后直接使用。 （1）组织粉碎 2. 哺乳动物细胞基因组DNA的抽提 * 第三十五页，共七十一页，2022年，8月28日 0.5%SDS和0.1mg/ml蛋白酶K。50 oC温育。 （2）细胞裂解 （3）纯化DNA 用苯酚和酚-氯仿抽提除去蛋白质污染。 SDS是离子型去垢剂（detergent），可以使细胞膜崩解。 （5）除去RNA污染 RNase。 无水乙醇（可以加入1/10体积的3M乙酸铵辅助沉淀） 异丙醇 （4）沉淀DNA * 第三十六页，共七十一页，2022年，8月28日 一般过程及原理： （1）组织粉碎 用液氮冷冻后研磨成细粉末。 3. 从植物组织中制备 DNA （2）细胞裂解 用2%CTAB/2-ME (十六烷基三甲基溴化铵/2巯基乙醇）。 或1% SDS和蛋白酶K。 65oC温育1h左右。 2% CTAB抽提缓冲液：CTAB 10 g；5 M NaCl 140 ml；0.5 M EDTA 25 ml；1 M Tris-Cl（pH 8.0） 50 ml；加ddH2O定容至500 ml。 * 第三十七页，共七十一页，2022年，8月28日 用0.6倍体积的异丙醇 （3）纯化DNA 用苯酚和酚-氯仿抽提除去蛋白质污染。 （4）沉淀DNA （5）除去RNA污染 用RNase A。 （可以加入1/10体积的3M醋酸氨辅助沉淀） 。 * 第三十八页，共七十一页，2022年，8月28日 三、噬菌体DNA的提取 噬菌体DNA一般都是从噬菌体颗粒中制得，不从被侵染细胞中制得，因此不存在被细菌DNA污染的问题。 但除去噬菌体衣壳过程中需要用到专门技术。 一个例外：M13噬菌体的双链复制模式，像细菌质粒一样，M13噬菌体DNA也能够从被侵染的大肠杆菌中获得。 * 第三十九页，共七十一页，2022年，8月28日 噬菌体颗粒能够从被侵染细菌的细胞外培养基中大量获得。 当这样的培养物被离心时，细菌聚集成小球沉淀在离心管的底部，把噬菌体颗粒留在了悬液中,噬菌体颗粒接着被从悬液中收集起来。 噬菌体DNA需要经过一个去除蛋白的步骤以除去蛋白衣壳后才能够得到。 * 第四十页，共七十一页，2022年，8月28日 * 第四十一页，共七十一页，2022年，8月28日 溶源性λ噬菌体的制备： 被侵染培养物主要是由含有已经整合到细菌染色体的前噬菌体的细胞所组成，在这种环境下，细胞外的λ噬菌体浓度非常低。为了得到高产量的细胞外λ噬菌体，培养物必须被诱导，以使所有细菌进入侵染循环中的溶解阶段，导致细胞死亡并将λ噬菌体颗粒释放到培养基中 1. λ噬菌体DNA的抽提 * 第四十二页，共七十一页，2022年，8月28日 * 第四十三页，共七十一页，2022年，8月28日 非溶源性λ噬菌体的制备 绝大多数的噬菌体都是溶源性噬菌体，但很多源自λ噬菌体的克隆载体都经过了改造，切除了一些基因以消除细菌的溶源性。因此这些噬菌体就不能够整合到细菌基因组中，并且只能够通过细菌溶解循环来侵染细胞。 * 第四十四页，共七十一页，2022年，8月28日 存在的问题：噬菌体在细胞分裂达到其最大分裂速度之前加入，所有细胞都会立刻溶解，这样得到的噬菌体浓度非常低。另一方面，如果细胞密度太高的情况下加入噬菌体，培养物不能够彻底溶解，所得的噬菌体浓度也比较低。 * 第四十五页，共七十一页，2022年，8月28日 * 第四十六页，共七十一页，2022年，8月28日 噬菌体颗粒在上清液中 一般过程及原理： （1）离心收集噬菌体颗粒 （2）聚乙二醇(PEG)沉淀噬菌体颗粒 聚乙二醇是一种长链多聚化合物，在盐存在下，能够吸收水分，使像噬菌体颗粒这样的大分子聚集沉淀 （3）重悬噬菌体颗粒 收集并在一个适当的小体积中重新溶解 * 第四十七页，共七十一页，2022年，8月28日 （4）CsCl密度梯度离心 * 第四十八页，共七十一页，2022年，8月28日