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微生物分子生态学研究方法会计学第1页/共53页 微生物群落结构和多样性是微生物生态学研究的热点内容。群落结构决定了生态功能的特性和强弱。群落结构的高稳定性是实现生态功能的重要因素。群落结构变化是标记环境变化的重要方面。通过对环境微生物群落结构和多样性进行解析并研究其动态变化，可以为调节群落功能和发现新的重要微生物功能类群提供可靠的依据。 微生物群落结构和多样性研究方法：第2页/共53页20世纪70年代以前：传统的培养分离方法，依靠形态学、培养特征、生理生化特性的比较进行分类鉴定和计数，认识是不全面和有选择性的，方法的分辨水平低。在70和80年代：对微生物化学成分的分析，建立了一些微生物分类和定量的方法（生物标记物方法），对环境微生物群落结构及多样性的认识进入到较客观的层次上。在80和90年代：现代分子生物学技术以DNA为目标物，通过rRNA基因测序技术和基因指纹图谱等方法，比较精确地揭示了微生物种类和遗传的多样性，并给出了关于群落结构的直观信息。第3页/共53页1、传统的微生物培养法虽然可以检测环境中的活细胞，并且对微生物生态学的发展起了很重要的作用。采用配比简单的营养基质和固定的培养温度，还忽略了气候变化和生物相互作用的影响，这种人工环境与原生境的偏差使得可培养的种类大大减少 （不到1 % ）。Amann 等人报道在自然环境样品中可培养的微生物占总的微生物数量的比例范围从0.001%（海水）到0.3%（土壤）。 不能全面地反映微生物区系组成状况，烦琐、耗时。第4页/共53页2、群落水平生理学指纹方法(CLPP)微生物所含的酶与其丰度或活性是密切相关的。如果某一微生物群落中含有特定的酶可催化利用某特定的基质，则这种酶-底物可作为此群落的生物标记分子之一。由Garlan和Mills于1991年提出的群落水平生理学指纹方法(CLPP)，通过检测微生物样品对底物利用模式来反映种群组成的酶活性的分析方法。具体而言，CLPP就是通过检测微生物样品对多种不同的单一碳源的利用能力，来确定哪些基质可以作为能源，从而产生对基质利用的生理代谢指纹。 BIOLOG鉴定系统第5页/共53页在96孔细菌培养板上检测微生物对不同发酵性碳源（95种）利用情况。干膜上都含有培养基和氧化还原染料四唑 微生物利用碳源进行呼吸时（产生的NADH），会将四唑从无色还原成紫色。菌悬液或无菌水每个孔中含有不同的底物 可鉴定细菌有1140多种、酵母菌267种、目前已经可用于丝状真菌。自动化、快速仅能鉴定快速生长的微生物，误差较大（pH），拥有的标准数据库还不完善第6页/共53页3、生物标记物法（Biomakers ）生物标记物通常是微生物细胞的生化组成成分，其总量通常与相应生物量呈正相关。 特定的标记物标志着特定的微生物，一些生物标记物的组成模式(种类、数量和相对比例)可作为指纹估价微生物群落结构。 首先使用一种合适的提取剂直接把生物标记物从环境中提取出来，然后对提取物进行纯化，后用合适的仪器加以定量测定。优点：不需要把微生物的细胞从环境样中分离，能克服由于培养而导致的微生物种群变化，具有一定的客观性。醌指纹法(Quinones Profiling)第7页/共53页呼吸醌广泛存在于微生物细胞膜中，在电子传递链中起重要作用，主要有泛醌(ubiquinone辅酶Q) 和甲基萘醌(menaquinone维生素K)。醌可以依据侧链含异戊二烯单元的数目和侧链上使双键饱和的氢原子数进一步区分。每一种微生物都含有一种占优势的醌，而且不同的微生物含有不同种类和分子结构的醌。因此，醌的多样性可定量表征微生物的多样性，醌谱图（即醌指纹）的变化可表征群落结构的变化。醌指纹法具有简单快速的特点。第8页/共53页磷脂脂肪酸（phospholipid fatty acid, PLFA）、甲基脂肪酸酯（Fatty acid methyl ester, FAME）谱图分析磷脂是构成生物细胞膜的主要成分，约占细胞干重的5%。在细胞死亡时，细胞膜很快被降解，磷脂脂肪酸被迅速的代谢掉，因此它只在活细胞中存在，十分适合于微生物群落的动态监测。脂肪酸具有属的特异性，特殊的甲基脂肪酸已经被作为微生物分类的依据。磷脂脂肪酸谱图分析法首先将磷脂脂肪酸部分提取出来，然后用气相色谱分析，得出PLFA谱图。甲基脂肪酸酯是细胞膜磷脂水解产物，气相色谱分析系统分析出全细胞的FAME谱图。脂肪酸谱图法分类水平较低，不能鉴定到种。另外，不同微生物种属之间脂肪酸组成有重叠，外来生物污染也限制了脂肪酸谱图法对种群结构解析的可靠性。第9页/共53页4. ERIC (肠杆菌基因间保守重复序列) -PCR指纹图谱技术第10页/共53页第11页/共53页第12页/共53页Di Giovanni 等用ERIC-PCR分析6种纯菌组成的混合菌的组成