4氮蓝四唑NBT法测定超氧化物歧化酶SOD活力.pdf

氮蓝四唑（NBT）法测定超氧化物歧化酶（SOD）活力）活力 一、原理 超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD ）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超 氧阴离子自由基的酶。本实验依据超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT ）在光下的还原作用 来确定酶活性大小。在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件 下极易再氧化而产生超氧阴离子自由基，超氧阴离子自由基可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙， 后者在 560nm 处有最大吸收。而处有最大吸收。而SOD 可清除超氧阴离子自由基，从而抑制了甲腙的形成。 于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。据此可以计算出 酶活性大小。 二、材料、仪器设备及试剂 （一）材料：植物叶片。 （二）仪器设备：高速台式离心机，分光光度计，微量进样器，荧光灯（反应试管处照度为 4000lx ），试管或指形管数支，黑色硬纸套。 （三）试剂 （1）0.05mol/L 磷酸缓冲液（pH7.8 ）。[0.2M的NaHPO91.5mL和NaHPO8.5mL混合后稀释4 2 4 2 4 倍]or[0.05mol/L PB 缓冲液（pH7.8 ）：7.1g/L ，6.8g/LKH PO ，按体积9:1 混合，如pH 高 2 4 或低于7.8 ，则用KH PO 或Na HPO 调节。每1000mL 缓冲液含8gNaCl8gNaCl，0.2gKCl] 2 4 2 4 提取介质：内含1%聚乙烯吡咯烷酮的上述缓冲液。 （2 ）130mmol/L 甲硫氨酸（Met ）溶液：称1.9399gMet1.9399gMet 用磷酸缓冲液定容至100ml。 （3 ）750µmol/L 氮蓝四唑溶液（NBT ）：称取0.06133gNBT 用磷酸缓冲液定容至 100ml，避 光保存。 （4 ）100µmol/L EDTA-Na 溶液：称取0.03721g EDTA-Na ，用磷酸缓冲液定容至1000ml。 2 2 （5 ）20 µ mol/L 核黄素溶液：称取0.0753g 核黄素用蒸馏水定容至1000ml，避光保存，现用 现配。 三、实验步骤 1.酶液提取 取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g 于研钵中液氮研磨成粉末，加2ml2ml 预 冷的提取介质在冰浴上研磨成浆，加入提取介质冲洗研钵，提取介质终体积为5ml 。取1.5-2ml 于4 ℃下10000r/min 下离心20min，上清液即为SOD 粗提液。 2.显色反应 取5ml 指形管或试管（要求透明度好）4 支，2 支为测定管，另2 支为对照管，按下表加 入各种溶液：[当样品数量较大时，可在临用前根据用量将表中各试剂（酶和核黄素除外）按 比例混合后每支试管一次加入2.65mL，然后依次加入核黄素和酶液，但终浓度不变。] 试剂名称 用量（mL ） 终浓度（比色时） 0.05mol/L 磷酸缓冲液 1.5 130mmol/L Met 溶液 0.3 13mmol/L 750µmol/L NBT 溶液 0.3 75µmol/L 100µmol/L EDTA-Na 溶液 0.3 10µmol/L 2 20 µmol/L 核黄素溶液 0.3 2.0µmol/L 酶液 0.05 2 支对照管以缓冲液代替酶 液