GB4789.3-2016大肠菌群平板计数法细节解读.docxVIP

GB4789.3-2016大肠菌群平板计数法细节解读 一、无需高压灭菌的VRBA培养基配制使用问题1.所用器皿是否需要灭菌？答：不需要。配制培养基所用到的锥形瓶、玻璃棒、勺子等均不需要灭菌，但要求一定要清洗干净，表面无污渍、无残留，且晾干无水渍。煮沸完成后，取下锥形瓶，用一般用锡箔纸覆盖瓶口，用橡皮筋缠绕，待冷却至适宜温度即可倾注培养基。在倾注培养基时，须点燃酒精灯，稍微灼烧锥形瓶口。 2.如何保持培养基“煮沸2min”？ 答：培养基加热煮沸至完全溶解一般采用电陶炉或电热炉进行，但培养基很难保持煮沸2min，一旦煮沸，则培养基很快上涌、翻腾，若不调低温度或立刻采取其他措施，则培养基可在数秒内喷涌出来，严重者可喷涌2米以上、电磁炉周围1—2米范围内都是培养基飞溅的范围（实验室危险因子之一）。因此，要做到“煮沸2min”，则需在该培养基即将煮沸时调低温度，待培养基一沸腾就马上移离热源，待培养基停止沸腾后，又继续加热至沸腾状态又移开，这样间歇性煮沸2min。（注意规范操作，做好防烫措施，避免烫伤）3.若培养基未用完，是否可以冷藏起来下次用？答：不可以。4789.28中已规定，固体培养基最多允许熔融1次（指的是经过高压灭菌冷却后的培养基还可以熔融一次后使用）。且VRBA培养基冷却后，再次熔融时非常容易喷涌，若温度控制不当，底部培养基熔融后很快就会发生喷涌。4.倾注完成后是否需要“覆盖一层”？如何覆盖？答：需要覆盖。因为培养基冷却后在表面容易形成一些冷凝水，菌落容易蔓延开，所以在倾注完成后，再覆盖一层培养基，则菌落不容易接触到水，这样不易形成蔓延菌落。在检验中最好都进行覆盖，最好是在原培养基已凝固或半凝固（不会发生晃动）时再倾注一层培养基（“一层”是指缓慢倾注培养基至培养基刚好能够覆盖整个平皿）。二、如何确定培养基上长的是不是大肠菌群？答：不要去管什么是大肠菌群的典型形态，建议新手们认真按照标准进行证实试验，此证实试验非常简单，每一次VRBA上有菌落生长都进行证实试验，如此往复3-4次，对于哪种形态才是大肠菌群已经能够了然于心了。建议平时多配一些BGLB肉汤管冷藏储存备用，需要进行证实试验时分分钟可以完成试验。三、两个梯度都长了菌，如何选取？如何进行证实试验？菌落选取数量？答：选取15-150CFU之间的平板（指的是VRBA平板上所有菌落数在此范围），挑取可疑菌落进行证实试验。详细举例说明：若有两个连续梯度的4个平板上菌落数均在15-150之间，则4个平板上的菌落都要挑取进行证实试验，实际操作时，可灵活操作，如：1:10的两个平板上的菌落数分别为120、123，1:100的两个平板的菌落数分别为16、18，严格来讲必须至少在每个平板上分别挑取5个可疑菌落、5个典型菌落进行证实试验。建议使用镍合金接种环（即传统的接种环，而不是一次性塑料接种环），因为VRBA上生长的菌落（无论典型或可疑）大部分长在底层、且菌落一般较大，被培养基覆盖，传统的接种环较细，用以刮去上层培养基较方便，挑取菌落也较方便。确证试验注意：1）.每种可疑菌落挑取5个，每个菌落放入1管GBLB管中；2）“产气者，记为大肠菌群阳性管”，就要求在实验前须认真筛选BGLB管，凡小导管中有气泡的GBLB管应先排去导管中的气泡再使用。VRAB平板上典型大肠菌群菌落形态BGLB确证阳性结果四、结果如何计算？答：首先，在VRBA培养24h后进行计数，分别计数可疑大肠菌群和典型大肠菌群的数量。例：10-4样品稀释液1mL，在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：100*6/10*104/g（mL）=6.0*105CFU/g（mL）。若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。五、若所选适合计数梯度平板上可疑和典型菌落，最终证实全部为阴性，结果如何计算？答：根据第3条,选取适宜菌落数的平板挑取菌落进行证实试验，若证实全部为阴性，则需要再挑取更低稀释度的平板上的菌落（建议可疑和典型菌落分别挑取10个）进行证实试验，若第二次证实试验均呈阴性，以＜1乘以最低稀释度进行计算，如：1:10的平板菌落数分别为120、123，1:100的平板上菌落数分别为16、18，首先挑取1:100的两个平板上的菌落进行证实试验，若全部为阴性，再挑取1:10的两个平板上的菌落进行证实试验，若1:10的平板上的菌落数证实为阴性，则最终计算过程为＜1x10，最终结果为＜10；若1:10的的平板上的菌落有阳性管，则按照第5条进行计算。