一种提取植物细胞核的方法.docxVIP

掌桥科研：一站式科研服务平台 掌桥科研：一站式科研服务平台 掌桥科研官网拥有中外文期刊、会议、学位、报告、专利等文献超3亿篇，以及查收、查引、查重、翻译等多种服务 掌桥科研官网拥有中外文期刊、会议、学位、报告、专利等文献超3亿篇，以及查收、查引、查重、翻译等多种服务 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10 )申请公布号 CN 109371017 A( 43 )申请公布日 (10 )申请公布号 CN 109371017 A ( 43 )申请公布日 2019.02.22 ( 22)申请日 2018 .12 .28 (71 )申请人 东北林业大学 地址 150000 黑龙江省哈尔滨市香坊区和兴路26号 申请人 黑龙江省林业科学研究所 (72)发明人 张欣 李红艳 杨传平 王玉成佟博通 于颖 周美琪 胡 萍 王艳敏 张一鸣 (74 )专利代理机构 哈尔滨市文洋专利代理事务 所( 普通合伙) 23210 C07K 1/34( 2006 .01 ) 代理人 何强 ( 51 )Int .Cl . 权利要求书1页 说明书6页 附图2页C12N 15/10( 2006 .01 ) C07K 1/14( 2006 .01 ) 权利要求书1页 说明书6页 附图2页 ( 54 )发明名称 一种提取植物细胞核的方法 ( 57 )摘要 CN 109371017 A一种提取植物细胞核的方法，它涉及一种提取细胞核的方法。本发明为了解决现有方法得到的细胞核纯度低的问题。本发明提取植物细胞核的方法为：一、预处理；二、第一次提取；三、细胞核粗提；四、细胞核粗提液的过滤；五、细胞核纯化。本发明方法解决了现有技术提取细胞核纯度低的问题，使用本发明方法提取的细胞核纯度达到了75％以上。 CN 109371017 A PAGE 2 PAGE 2 掌桥科研官网拥有中外文期刊、会议、学位、报告、专利等文献超3亿篇，以及查收、查引、查重、翻译等多种服务 2 2 CN 109371017 A权 利 要 求 书 1/1 页 CN 109371017 A 1 .一种提取植物细胞核的方法，其特征在于提取植物细胞核的方法按照以下步骤进行： 一、预处理：植物材料去除杂质，洗涤后吸干水分； 二、第一次提取：取1～2g步骤一预处理后的材料和4～6g的锆珠放入研磨管中，再向研磨管中加入10mL pH为7 .5的buffer A溶液混合后研磨2～4次，离心，分别收集上清和沉淀； 其中buffer A溶液中Tris-HCl浓度为20mM、KCl浓度为10mM、蔗糖浓度为250mM、MgCl2浓度为1 .5mM、β-Mercaptoethanol浓度为5mM、蛋白酶抑制剂浓度为1mM；研磨条件是研磨速度为 6 .5m/s、每次研磨时间为1min，每次研磨间隔时间为1min；离心条件是离心力为125g、离心时间为7min； 三、细胞核粗提：步骤二的沉淀提取5～6次，提取条件为向沉淀中加入8～1 2mL的 buffer A溶液混合研磨、离心，研磨条件是研磨速度为6 .5m/s、每次研磨时间为1min；离心条件是离心力为125g、离心时间为7min；收集每次得到的上清液混合，得到细胞核粗提液；四、细胞核粗提液的过滤：步骤一得到的上清液和步骤三得到的细胞核粗提液混合，然 后用N层的200目的尼龙网过滤，滤液离心2次，离心温度为4℃、离心力为400g、每次离心时间为10min，收集沉淀； 五、细胞核纯化：步骤四中的沉淀用20mL pH为7 .5的buffer B溶液重悬合并，洗涤2次， 离心收集细胞核即得到植物细胞核；其中buffer B溶液中Tris-HCl浓度为20mM、KCl浓度为 10mM、蔗糖浓度为250mM、MgCl2浓度为1 .5mM、蛋白酶抑制剂浓度为1mM、β-Mercaptoethanol 浓度为5mM、Triton x-100浓度为0 .1％，每次洗涤步骤为振荡器震荡30s、冰浴2min，然后在 4℃下、离心力为400g、离心10min。 2 .根据权利要求1所述一种提取植物细胞核的方法，其特征在于步骤二中锆珠大小为8 ～12mm。 3 .根据权利要求1或2所述一种提取植物细胞核的方法，其特征在于步骤二和步骤五中的蛋白酶抑制剂为PMSF或1×proteinase inhibitor cocktail。 掌桥科研：一站式科研服务平台 说明书CN 109371017 A1/6 页 掌桥科研：一站式科研服务平台 说 明 书 CN 109371017 A 1/6 页 一种提取植物细胞核的方法 技术领域 [0001] 本发明涉及一种提取细胞核的方法。 背景技术 [0002] 植物细胞非对称融合、染色体杂交育种、大片段基因组