核酸分离纯化.pptVIP

2.基因组DNA的分离与纯化; ? 核酸的分类、分布及意义;Paper Towels;第一节 核酸分离与纯化的原则; 实验要求： 1.质量高:完整性、产量、纯度和浓度符合实验要求； 2.方法好：简便快速、安全、经济； 3.标本易得:血液、尿液、组织切块、培养的细胞和细菌等。; 核酸完整性的保持： 1.避免过酸和过碱环境，pH在4-10之间； 2.避免高温破坏，0-4?C进行； 3.简化步骤，缩短时间，减少破坏； 4.抑制DNA酶和RNA酶的活性:用EDTA、柠檬酸盐络合Mg2+、Ca2+等离子。;二、技术路线的设计; 核酸的分离与纯化： 1.除去蛋白质、多糖、脂类等大分子物质； 2.除去非目的核酸组分： 3.除去实验溶液和试剂： ; 核酸的浓缩、沉淀与洗涤： 1.浓缩：提高样品浓度； 2.沉淀：常用的浓缩方法，如醋酸钠、醋酸铵等 3.洗涤：除去共沉淀的盐，常用70%-75%的乙醇。 ;三、核酸的鉴定与保存; 2. 荧光光度法： 原理：荧光染料溴化乙锭（ethidium bromide EB）嵌入碱基平面，在紫外光的激发下产生橙红色荧光 粗略定量：与分子量标准物对比； 准确定量：荧光分光光度计，灵敏度达1-5ng/ml 其它荧光染料：SYBR gold，灵敏度达20pg/ml； SYBR GreenI等 适用浓度：大于 0.25?g/ml ; 纯度鉴定： 1. 紫外分光光度法： 原理：蛋白质和核酸紫外吸收特性的差异 ; 纯度鉴定： 1. 紫外分光光度法： 原理：蛋白质和核酸紫外吸收特性的差异 纯DNA：A260/A280=1.8，纯RNA：A260/A280=2.0； 比值降低：蛋白质污染（280）、酚污染（270） 比值升高：DNA变性、RNA污染 混合污染：比值正常 缓冲液的影响：在TE缓冲液和水、Tris等缓冲液中的比值有变化，应注意校正。 ;核酸的紫外吸收特性 ; 2. 荧光光度法： 原理：凝胶电泳观察图谱 RNA电泳图谱：原核生物5S、16S、23S三条带； 真核生物：5S和5.8S、18S、28S三条带； DNA分子大，迁移率小 ; 完整性鉴定： 1. 凝胶电泳法： 根据电泳条带的数目、位置和形状判定 RNA分子可以通过荧光强度积分来判定有无降解。 2.其它方法：逆转录法、核酸杂交、芯片检测等。 ;Sample Well 25 ng 1 kb ladder 0.8% Agarose;Results of Southern Blot; 核酸的保存： 1. DNA的保存：-70?C，TE缓冲液中数年，加入氯仿可防止污染 原理： 2.RNA的保存： -70?C，醋酸钠溶液或焦碳酸二乙酯（DEPC）溶液中，较长期保存。;第二节 基因组DNA的分离与纯化 ;基因组D NA分离纯化技术路线;盐析法沉淀;酚抽提法 ;DNA样品的纯化： 1. 分子大，容易断裂 2.容易污染其它来源的DNA 纯化方法： 1.透析 2.层析 3.选择性沉淀 4.凝胶电泳;Agarose Gel Electrophoresis;回收方法： 1.DEAE纤维素膜插片电泳 2.转膜电泳法、透析袋电泳法 3.凝胶洗脱法 4.冷冻挤压法 5.低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法 6.回收试剂盒：以硅为基础;（一）细菌的培养 　　1.菌种的选择:大肠埃希菌 2.培养基的选择:L-B培养基 3.筛选标记的确定:抗生素 4.生长状态的确定:对数生长期，测定OD600达0.4-0.6之间 　;（二）细菌的收获和裂解 　　1.细菌的收获：离心，小量制备用1-1.2ml，大量制备用100-150ml 2.细菌的裂解：可以用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理等。选择哪一种方法取决于３个因素：质粒的大小、小肠杆菌菌株及裂解后用于纯化质粒DNA的技术。 　;　　;　● 小质粒：在加入EDTA后，有时也加入溶菌酶，让细菌暴露于去污剂，通过煮沸或碱处理使之裂解。这些处理可破坏碱基配对，故可使宿主的线状染色体DNA变性，但闭环质粒DNA链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。当条件恢复正常时，质粒DNA链迅速得到准确配置，重新形成完全天然的超螺旋分子。　　　　; (三)质粒DNA的纯化? 　　原理：质粒DNA相对较小；共价闭合环状 方法：用氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心： ( 每２个碱基对大约结合１个溴化乙锭分子) 。; 缺点：昂贵