ELISPOT实验技术分析和总结.pdf

酶联免疫斑点技术介绍 一、 ELISPOT技术概述 1. 技术原理和技术特点 ELISPOT 全名为酶联免疫斑点检测，英文：Enzyme-linked Immunospot Assay 。 它结合了细胞培养技术与酶联免疫吸附技术（即ELISA 技术），能够在单细胞水 平检测细胞因子的分泌情况。其技术原理，一句话概括就是：用抗体捕获培养中 的细胞分泌的细胞因子，并以酶联斑点显色的方式将其表现出来（Sedgwick JD 2005 ）。 该技术检测细胞因子具有三大优点：其一，灵敏度高。在一百万个阴性细胞中只 要有一个分泌细胞因子的阳性细胞即可被检测出来。这是目前为止，最为灵敏的 检测技术，灵敏度比传统的的ELISA 方法高2-3 个数量级。其二，单细胞水平， 活细胞功能检测。ELISPOT 检测的是单个细胞分泌，而非细胞群体的平均分泌。 在检测的过程中，有活细胞培养与抗原刺激阶段，检测的是活细胞的功能，而非 死细胞的遗留物。其三，操作简便经济，可以进行高筒量筛选。ELISPOT 没有 复杂的细胞体外扩增过程，不使用同位素，不需要大型的、专门的实验仪器设备。 按照标准化的实验操作，一个实验者可以同时处理数百个样品，效率远远高于其 它检测方法（Kalyuzhny AE 2005）。 实验设计在96 孔培养板上进行，直接以培养板的塑料板底或者PVDF 膜以及硝 酸纤维素膜为基质，包被上特异性的单克隆抗体，用以捕获细胞分泌的细胞因子。 （由于涉及到细胞培养的过程，对单克隆抗体的要求要远高于ELISA 中的捕获 抗体，该抗体需要无毒，不含内毒素，亲和力高等特点。）之后，在培养板的孔 内加入细胞培养基（现在无血清ELISPOT 技术已经成熟，培养基中可以不再含 有血清）、待检测的细胞以及抗原刺激物进行培养。 在特异性的抗原或者非特异性的有丝分裂原的刺激下，数小时之内，T 细胞就会 开始分泌各种细胞因子。细胞因子当即就被位于细胞下方的膜上的单克隆抗体所 捕获。在洗去细胞之后，被捕获的细胞因子可以与生物素标记的第二抗体结合， 然后用酶标亲和素再与生物素结合，进行化学酶联显色，就可以在膜的局部形成 一个个圆形的斑点。每一个斑点就对应了当初一个分泌细胞因子的细胞，这些细 胞被称为斑点形成细胞（Spots forming cells SFCs ）。统计膜上的斑点的数目，再 除以当初加入孔内的细胞总数，就可以计算出阳性细胞的频率。其实验原理如图 一所示： 图一：ELISPOT技术原理 1.特异性的单克隆抗体包被在培养板的孔底部；2.封闭所能结合单瓣的其他部位；3.加入细 胞及以及刺激物培养，阳性细胞分泌细胞因子，被细胞下方的单克隆抗体捕获；4.移出细胞， 洗涤；5.加入生物素标记的第二抗体（和双抗体夹心法ELISA 类似）；6.加入酶标链霉亲和 素；7 加入显色底物，在酶的催化分解下，产生不可溶的色素，就近沉淀在局部的膜上形成 斑点；8.斑点计数（可以人工计数，也可以使用自动的读板仪来计数），数据处理，结果分 析。 2. ELISPOT的发展历史 ELISPOT 方法从创立至今已经有20 多年的历史了。1983 年，在地球南北两 个半球地理位置相距遥远的两个研究小组几乎同时、独立的创立了这项技术。一 个研究小组位于澳大利亚西部的柏斯 Peth ，牵头人是当时正在当地Margaret 女 王医院儿童医学研究所攻读博士学位的Jonathon D. Sedgwich （Sedgwick JD et. al., 1983 ）。另一个研究小组位于北欧瑞典城市哥德堡Gothenburg，带头人是哥德 堡大学医学微生物系的学者Cecil C. Czerkinsky （Czerkinsky CC et. al., 1983a ）。 前者开创ELISPOT 方法是为了研究B 淋巴细胞分泌IgM 抗体的情况（Holt PG et. al., 1984 ；Sedgwick JD et. al., 1984 ）；而后者除了用于研究B 淋巴细胞分泌抗体 的情况（Czerkinsky CC et. al., 1983b; 1983c），还应用于大肠杆菌分泌肠毒素 （Czerkinsky CC et.al.,