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第3章 细胞生物学研究方法本章主要内容细胞形态结构的观察方法细胞及其组分的分析方法细胞培养与细胞工程细胞及其生物大分子的动态变化模式生物与功能基因组的研究第一节 细胞形态结构的观察方法直径分辨率病毒 20-200 nm支原体 0.1-0.3 μm细菌 0.5-5.0 μm动植物细胞 20-30 μm活细胞多是无色透明的肉眼 0.2 mm光学显微镜 0.2 μm电子显微镜 0.2 nm扫描隧道显微镜样品制备技术一、光学显微镜 (light microscope)从细胞的发现、细胞学说的建立，直至今天光学显微镜仍然是细胞生物学研究的重要工具1. 目镜 2. 准焦螺旋3. 物镜 4. 载物台5. 反光镜（一）普通复式光学显微镜——组成由3 部分组成：光学放大系统（目镜与物镜） 照明系统（光源和聚光镜）镜架及调节系统（一）普通复式光学显微镜——成像放大的倒立虚像经物镜形成倒立实像经目镜进一步放大成虚像（一）普通复式光学显微镜——分辨率分辨率（resolution）：显微镜最重要的性能参数分辨率是指能区分开两个质点间的最小距离普通光学显微镜最大分辨率0.2 μm（一）相机分辨率（一）相机分辨率像素（Pixel）?像素是组成数字图像或照片的最基本单元。数字图像或照片是由无数颜色不同、浓淡不一样的不相连的“小点”组成的。这些小点，就称之为像素。像素点分布越密集，越能把物体的细节表现出来。所以，照片的像素越高，就可能越细腻。像素越低，照片就越粗糙，很多细节就难以表现出来。??分辨率（resolution）。分辨率是和图像相关的一个重要概念，是指单位长度内包含的像素点的数量。它是衡量图像细节表现力的技术参数。分辨率通常是以像素数来计量的，它的单位通常为：像素/英寸（ppi）。（表示每英寸内有多少像素点）。通常情况下，图像的分辨率越高，所包含的像素就越多，图像就越清晰，印刷的质量也就越好。同时，它也会增加文件占用的存储空间。（一）普通复式光学显微镜——样品制备石蜡切片H.E染色Figure 9-10, 11a Molecular Biology of the Cell (? Garland Science 2008)（二）相差显微镜和微分干涉显微镜利用光线干涉的原理，将相位差转换成振幅差，实现对非染色活细胞的观察A. 当两束光的相位相同时，相互干涉的结果使光波的振幅增加, 亮度增强；B. 当两束光的相位相反时，则导致光波的振幅降低，亮度变暗。（二）相差显微镜和微分干涉显微镜相差显微镜是在普通光学显微镜的基础上，添加 “环状光阑”和 “相差板”，将光程差或相位差，转换成振幅差体外培养MDCK 细胞在普通（明视场）光学显微镜（A）和相 差显微镜（B）下拍摄图像效果的比较（二）相差显微镜和微分干涉显微镜微分干涉显微镜以平面偏振光为光源，使样品中厚度上的微小区别转化成明暗区别分辨率比普通光镜提高了一个数量级录像增差显微镜可以用来直接观察颗粒物质沿着微管运输的动态过程Figure 9-9 Molecular Biology of the Cell (? Garland Science 2008)Four types of light microscopy (A) The image of a fibroblast in culture obtained by the simple transmission of light through the cell, a technique known as bright-field microscopy (B) phase-contrast microscopy (C) Nomarski differential-interference-contrast microscopy (D) dark-field microscopyFigure 9-8 Molecular Biology of the Cell (? Garland Science 2008)（三）荧光显微镜——基本原理荧光：分子吸收入射光能量后电子从基态跃迁到激发态，再从激发态回到基态而发出的可见光(波长比入射光长)（三）荧光显微镜——基本原理光源和光学系统与普通光学显微镜不同核心部件是滤光片系统及专用物镜镜头滤光片系统由激发滤光片和阻断滤光片组成（三）荧光显微镜——样品制备免疫荧光技术荧光素直接标记技术绿色荧光蛋白(GFP)的基因与编码某种蛋白质的基因相融合表达两种以上荧光素标记同一样品，可同时显示不同成分在细胞中的定位（三）荧光显微镜——应用在光镜水平上，对细胞内特异的蛋白质、核酸、糖类、脂质以及