荧光定量PCR引物设计.docx

荧光定量 PCR 引物设计专业的定量 PCR 设计软件： beacon Designer 有时一对 100 分的引物扩增效率特别低， 换了一对貌似很烂的引物， 结果溶解曲线却长得很漂亮～扩增效率也蛮高。个人认为这个跟你选择的位置有关 看引物 Tm 值相差是否很高，适当降低反应退火温度，看看是否有效 看所扩增片段 GC 含量以及产物 Tm 是否很高，比方水稻基 cDNA 扩增常常用到 GC buffer。 看所用扩增基因是否为组织特异性表达 看 RNA 是否完整是否降解，反转录过程是否完整设好内参正对照 最后，所有这些都满足还是没扩增出来，重新设计引物吧， ）设计的时候尽量靠近基因的 3端，这样能最大限度地保证扩增效率 ）尽量跨越内含子，这样可以保证检测有无基因组污染 ）两条引物的 Tm 值不要相差太大 ）产物长度保证在 80～ 200bp 之间，最长 300 bp。.如果想同时检测很多对基因的变化， 最好设计的时候记录下产物的 Tm 值，这对你后面的实验设计读板温度很有帮助。保证在产物 Tm80 以上（一般 Tm=80 以下的峰都是引物二聚体） ， 对于水稻等 GC 含量比较高的基因组，产物 Tm 不要高于 94(个人观点 )。如果同时检测很多对基因的表达量变化， 我会尽量调整所有产物的 Tm 值和内参产物的Tm 相差不太大，这样方便实验操作和最后的分析。 （ 3）相对错配来说，我认为 dimer 和 harpin 对 realtime PCR 的影响更大（当然， 也别错配得太邪门了， 非来一条跟产物出峰在相同位置或者比产物峰还高的错配就死了），引物的 3端不要有错配。 （ 5）一般我们用 Primer Premier 设计软件，我一般先让软件自动有哪些信誉好的足球投注网站正义链或反义链的引物， 找到一条评分是 100 的，再在它左右合适的位置手动有哪些信誉好的足球投注网站有没有合适和它配对的评分也比较高的引物，一般 5 分钟之内可以搞定一个基因。实时定量 PCR 引物设计的具体要求 1、引物使用核酸系列保守区设计并具有特异性。最好位于编码区 5端的 300-400bp 区域内，可以用 DNAMAN ，Alignment 软件看看结果。 2、不能形成 2 级结构。 3、引物长度一般在 17-25bp 之间，上下游引物不能相差太大。 4、G+C 含量在 40-60%之间， 45-55%最佳。 5、碱基要随机分布，尽量均匀。 6、引物自身不能有连续 4 个碱基的互补。 7、引物之间不能有连续 4 个碱基的互补。 8、引物 5‘端可以修饰。 9、3’端不可修饰， 而且要避开 AT ，GC rich 的区域，避开 T/C, A/G 连续结构（2-3个）。 10、引物 3端要避开密码子的第三位。 11、引物整体设计自由能分布 5端大于 3‘端。 12、定量产物长度 80-150bp 最好，最长是 300bp。 实时定量 PCR 完全手册 方法简介 所谓的实时荧光定量 PCR 就是 通过对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量 PCR 反应中，引入了一种荧光化学物质，随着 PCR 反应的进行， PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。 每经过一个循环， 收集一个荧光强度信号， 这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化， 从而得到一条荧光扩增曲线。 广义概念下的定量 PCR 技术可以分为五种类型： （ 1）外参法 +终产物分析。所谓 “外参法 ”是指样本和阳性参照在两个反应容器内反应。这种类型没有对样本进行质控监测，易出现假阴假阳结 果，没有监测扩增效率，定量不准。 （ 2）内参法 +终产物分析。所谓 “内参法 ”是指样本和阳性参照在一个反应容器内反应。这种类型对样本进行质控监测，排除假阴结果，但是定 量不准。 （ 3）外标法 +过程监测。这种类型监测扩增效率，阳性样本定量准， 但是无法排除假阴结果。 （ 4）内参法 +过程监测。由于样本和阳性参照在一个容器内反应，用同样的 Taq 酶和反应参和物，存在竞争性抑制，起始模板量浓度高的反应会抑制起始模板量浓度低的反应，所以定量不准。 （ 5）外标法 +过程监测 +内对照。这种类型监测扩增效率，阳性样本定 量准，同时排除假阴结果。这种类型是应该提倡的。 在国家没有出台阴阳判定标准时，所用 PCR 系统灵敏度最好达到一个拷贝（一个病毒） 。从理论上说，只要有一个拷贝数，样本就算阳性；一个拷贝数都没有才算阴性。 所谓的实时荧光定量 PCR 就是 通过对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时 荧光定量 PCR 反应中，引入了一种荧光化学物质， 随着 PCR 反应的进行， PCR 反应产物不断累计