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小分子人工抗原的制备方法 小分子人工抗原的制备方法 PAGE PAGE 3 PAGE 3 小分子人工抗原的制备方法 小分子人工抗原的制备常用方法 一、 碳二亚胺（EDC）法（制备 KAN-BSA ） A 液的制备：准确称取 BSA 20mg，EDC 55mg，使之充分溶解于 2mL PBS 中，4℃避光搅拌反应 6h，得到反应液为 A 液； B 液的制备：准确称取卡那霉素标准品 50 mg，加入 mL M PBS 中，边加边搅拌，使之充分溶解后所得溶液称为 B 液； 将上述 B 液逐滴加入 A 液中（边加入边搅拌），密封，避光，在 4℃下搅拌过夜； 待上述反应完后，将反应液转移到处理好的透析袋中，4℃用 PBS 透析 3d，透析第一天每 3h 换液一次，以后每 8-10h 换液一次； 透析完成后，将偶联产物分装于 ep 管中，于-20℃保存备用。本实验将其作为免疫原。 戊二醛（GA）法（制备 KAN-GA-OVA ） A 液的制备：准确称取卡那霉素标准品50mg，量取 %戊二醛溶液 1mL， 先后将二者充分溶于 2 mL 的 PBS 中，于4℃，避光搅拌反应 30 min，所得反应溶液称为A液； B液的制备：准确称取OVA 150 mg，将其充分溶于 5mL PBS 中，得到的溶液称为B液； 将上述 B 反应液逐滴加入到 A 反应液中，边加入边搅拌，再向反应溶液中加入约硼氢化钠，调节溶液pH至，于4℃避光搅拌反应2h； 用 PBS 透析，4℃透析5d，每8h换液一次，透析完成后，将反应液分装于离心管中，放于-20℃冻存备用。 混合酸酐法（制备克百威人工抗原） 取半抗原克百威（BFNH或BFNB）溶解在DMF（二甲基甲酰胺）中，然后在该溶液中加入等当量的正三丁胺和氯甲酸乙酯，在室温下反应1h； 取反应液500ul加入到5ml 15mg/ml的BSA碳酸缓冲液中，在磁力搅拌下反应2h； 反应完成后，蒸馏水透析2次；%生理盐水透析； 紫外扫描测定结合比，于-20℃保存备用。 活泼酯法（制备克百威人工抗原） 克百威半抗原BFNB的合成及纯化 取一四口烧瓶置于恒温磁力搅拌器上,配置温度计。 称取 g呋喃酚溶解于50 mL二氯甲烷(DCM)中,冰浴下加入 g三乙胺(Et3N)，搅拌10 min； 将 g二(对硝基苯)碳酸酯溶于15 mL二氯甲烷中,缓慢滴加到上述反应体系中,缓慢升温至室温,继续搅拌反应1 h,TLC板监控反应完成,展开剂为V(石油醚) : V(乙酸乙酯)=10 : 1,此为溶液A; 称取1. 697 g经三乙胺碱化的4-氨基丁酸甲酯盐酸盐溶于10 mL二氯甲烷中,在冰浴下滴加到A液中,将温度升到室温并继续搅拌过夜; 用水、饱和食盐水依次洗涤并用无水硫酸钠干燥,滤液真空旋干后用硅胶柱层析纯化,得到半抗原中间体B; 将B溶于15 mL 1,4-二氧六环溶液中,加人18 mL三氟醋酸和15 mL水,60 C反应4 h后冷却至室温; 反应液用乙酸乙酯萃取后，依次用水、饱和碳酸氢钠、水、饱和食盐水进行洗涤,用无水硫酸钠干燥,滤液真空旋干后用硅胶柱层析纯化后即可得到克百威半抗原BFNB，洗脱剂为V（石油醚）:V（乙酸乙酯）=5:1； 半抗原BFNB鉴定 将纯化后的克百威半抗原BFNB采用核磁共振仪和LC-GC进行分子结构鉴定，已确定半抗原是否合成成功； 完全抗原的合成 免疫原（BFNB-BSA采用活性酯法进行合成，控制半抗原BFNB与载体蛋白BSA的反应摩尔比为80:1； 称取 mg半抗原BFNB， mg NHS溶于1ml无水DMF中，充分溶解完全； 加入 mg DCC（N,N-二环己基碳酰亚胺）室温搅拌反应过夜； 离心去沉淀，收集上清，此为A液； 称取BSA 83 mg溶解在5 ml mol/L PBS溶液中，为B液； 在冰水浴中，将A液逐滴滴加到B液中，4℃搅拌过夜； 反应混合液用PBS缓冲液透析3 d，6-8 h换液1次，离心取上清，分装于 ml 离心管中，-20℃保存备用。 包被原（BFNB-OVA）在合成中，载体蛋白为OVA，半抗原BFNB与OVA的反应摩尔比为40:1，其余步骤与免疫原的合成相同。