基因重组与基因工程技术课件.pptxVIP

重组DNA技术--基因重组与基因工程; ; 现代基因工程的创始人P·伯格（美国,1926－）在1960年以敏锐的科学预见力提出一个大胆的设想：是否可以创造出一种人工方法，把外界的遗传基因引入动物体内，以达到改变遗传性状和治疗某些疾病的需要呢？1972年，伯格把两种病毒的DNA用同一种限制性内切酶切割后，再用DNA连接酶把这两种DNA分子连接起来，于是产生了一种新的重组DNA分子，首次实现两种不同生物的DNA体外连接，获得了第一批重组DNA分子，这标志着基因工程技术的诞生。伯格因此获得了1980年诺贝尔化学奖。 ; 1973年，美国斯坦福大学教授S·科恩和加州大学旧金山分校教授H·W·博耶将两个不同的质粒（一个是抗四环素质粒，另一个是抗链霉素质粒）拼接在一起，组成嵌合质粒，并将其导入大肠杆菌，当该重组质粒进入大肠杆菌体内后，这些大肠杆菌能抵抗两种药物，而且这种大肠杆菌的后代都具有双重抗药性。这表明“杂合质粒”在大肠杆菌的细胞分裂时也能自我复制。;;DNA重组的基本模式; ;(分)------目的基因及载体的分离;从基因所在生物直接取得 --用限制酶剪切供体DNA --用机械的方法eg 超声波;化学合成法;化学合成的最大优点是可以合成一些分离较困难的基因。 化学合成的不足之处在于： --要已知基因的核苷酸顺序； --基因不能太大，这一方面是测定核苷酸（或氨基酸）顺序比较困难，另一方面是因为每次仅能合成几百ｂｐ的短片段，短片段越多，要连接成正确的基因顺序就越困难，得率越低； --价格昂贵。 用途： PCR引物,测序引物,定点突变,核酸杂交探针;从基因文库中筛选;从mRNA反转录合成cDNA;聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）;载体DNA的选择;质粒 噬菌体 腺病毒载体 逆转录病毒载体 ……;质粒载体的一般结构;;DNA重组的基本模式;切------限制性内切酶酶切;载体和目的基因的切断;酶切 --双酶切： 体系：选择合适的缓冲体系，尤其是双酶切反应中。 DNA：经过纯化的，尽量不含有蛋白质，酒精等杂质。 时间：一般为5-7h，载体overnight以保证酶切完全。不能时间过长，以防止内切酶的star活性，降低特异性。 酶切之后立即回收，小片段用PCR-purification Kit 除去，大的片段要用切胶回收去除。;T-vector;DNA重组的基本模式;接------载体和目的基因的连接;载体DNA与目的基因的连接;（二）人工接尾法： 即同聚物加尾连接法。当载体和目的基因无法采用同一种限制酶进行切断，无法得到相同得粘性末端时，可采用此方法。 此法首先使用单链核酸酶将粘性末端切平，再在末端核苷酸转移酶的催化下，将脱氧核糖核苷酸添加于载体或目的基因的3-端，如载体上添加一段polyG，则可在目的基因上添加一段polyC，故二者即可通过碱基互补进行粘合，再由DNA连接酶连接。 ;末端转移酶（terminal transferase）  该酶全称为末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase），它所催化的反应与DNA pol I 相似，所不同的是它不需要模板，它可以含有３’－ＯＨ的ＤＮＡ片段为引物，在３’－ＯＨ端加入核苷酸达几百个。末端转移酶常用于在平头ＤＮＡ上合成一段寡聚核苷酸，从而形成粘性末端。;;（三）人工接头连接法： 将人工连接器（linker，即一段人工合成的含有多种限制酶切点的小分子DNA片段，约10~20个核苷酸）连接到平末端DNA分子(载体和目的基因)上，即有可能使用同一种限制酶对载体和目的基因进行切断，得到可以互补的粘性末端。 这种方法的优点是克隆位点具有限制酶的酶切位点。;连接体系的建立： 温度：粘末端连接：12-18℃ (16-20 hours) 平末端连接：室温（低于30℃) DNA量：载体分子数/目的基因分子数=1：3-5 酶量：平端连接时需加大酶量 连接反应体系越小越好，相对而言，酶切体系稍大较好;连接失败后-- 一步一步向上游检测问题所在，所以分子 克隆部分“留一半”的原则有时候是很有用的。 酶切是否完全，所以要做载体的自连对照。 载体酶切回收是否考虑到切除片段的大小， 是否要用切胶回收更保险。;DNA重组的基本模式;转------重组体的转化;宿主菌或受体细胞;原核细胞的转化（细菌转化）;感受态细胞（competent cell）;大肠杆菌感受态细胞的制备( 化学方法);一、 受体菌的培养 从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落,接种于3-5ml LB液体培养基中，37℃下振荡培养12小时左右,直至对