聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质liuchangPPT课件.pptVIP

实验九：聚丙烯酰胺凝胶电泳法  分离血清蛋白质; 实验目的;具体安排;电泳的基本原理; 带电粒子的运动速度迁移率μ ; 影响电泳速度的因素;a. 电荷 b. 分子大小 c. 形状 ; 电场（三要素）;缓冲液;支持介质（物）;电泳分类;PAGE实验原理; ; 丙烯酰胺(Acr); 分类（根据有无浓缩效应） 连续电泳： 电泳体系中缓冲液组成、pH值及 凝胶孔径大小都相同。 电荷效应、分子筛效应 不连续电泳：电泳体系中缓冲液组成、pH值 及凝胶孔径大小都不相同。 电荷效应 、分子筛效应、浓缩效应;不 连 续 电 泳; ;分子筛效应;实验操作;一、制胶(本实验的关键步骤) 1、安装玻板： 将洗净的、带白色边条的玻板水平放好，将U型硅胶密封条摆好。然后，将不带边条的短玻板盖在U型硅胶密封条上。 ;2、安装铁夹：用4只铁夹将安装好的玻板夹好。 注意：1）夹子的作用点应和白色边条重合， 避免夹到边条内侧，造成玻板变形。 2） 玻板下沿的两个夹子尽量下移， 使之能够起到“腿”的作用，保证玻板处于直立状态。 ;3、配制聚丙烯酰胺凝胶: 每种试剂用相应的吸量管、滴管来吸，吸量管上有标记。 不可混用，否则污染试剂，影响实验结果。; 分离胶的配制; 灌注分离胶; 另一小烧杯中按下列顺序加入：（D液有毒性，尽量不要接触到皮肤） 1——C液（Tris-HCl） 0.4 ml 2——D液（Acr-Bis） 0.8ml 3——E液(核黄素） 0.3 ml 4——过硫酸铵 0.6 ml 5——蒸馏水 0.9 ml 混匀 6——TEMED 1-2滴; 轻轻混匀，快速倾倒进玻璃板间的缝隙,液面高度与矮板相平。 插入样品槽模板（又称梳子），不要带进气泡。 整个装置在紫外线下照射30分钟，使浓缩胶充分聚合（光聚合）。; 每四组配制一份，再分装成4小份即可。 1——血清 0.3 ml （吸血清的吸量管用后要马上清洗，以免堵塞） 2——C液 1.0 ml 3——20%或40%的蔗糖 3.0 ml 4——0.05%溴芬兰 0.4 ml （思考2：为什么加2、3、4这三种液体？） ; 安装电泳槽,加入电极缓冲液（ F液）;;;加样:加样器针尖贴着高玻璃板伸到加样槽中间位置加样，针尖不要扎破下面的胶面。 加样量:10 ul -50 ul;; 电泳;;; 观察并记录电泳现象;??胶：拆开电泳槽装置，用竹镊子轻轻撬开两层玻璃板，戴上一次性手套，用手和镊子将分离胶剥离到染色液盘内，染色15分钟。 脱色： 将分离胶小心完整地从染色液中移到脱色液内，脱色三次，每次10分钟（每次更换新鲜脱色液80-100ml），脱色时在摇床上摇。;; 点样线 ? ? ?2 ?1 清蛋白 血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳示意图;;;聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质liuchangPPT课件