生物化学：基因表达调控 (2).pptVIP

转染大肠埃希菌时，线状的重组DNA被注入细胞内。在细胞内通过黏性末端而环化，环化后的分子含有完整的柯斯质粒载体，像质粒一样繁殖并使宿主菌表现抗药性，可用含抗生素的培养基进行培养。 4．动物病毒载体 具有在动物细胞中被识别的复制表达体系，可用于真核细胞的基因转移，尤其是以基因治疗为目的的系统，主要是因为病毒基因组的结构相对简单，分子背景清楚，易于改造和操作，且转染率高。 现在较为常用的病毒载体有反转录病毒、腺病毒和痘苗病毒等。 4．动物病毒载体 SV40-猴空泡病毒40，通过感染方式将其DNA送入哺乳动物细胞中进行增殖。 SV40病毒的基因组是一种环形双链的DNA，基因组5.2kb，病毒的直径45nm，病毒成熟部位细胞核，无被膜，72个核壳粒亚单位，这种大小很适于基因操作。同时它也是第一个完成基因组DNA全序列分析的动物病毒。 理想的基因工程载体一般至少有以下几点要求： ① 能在宿主细胞中复制繁殖，而且最好要 有较高的自主复制能力。 ② 容易进入宿主细胞，而且进入效率越高 越好。 ③ 容易插入外来核酸片段，插入后不影响 其进入宿主细胞和在细胞中的复制。 ④ 容易从宿主细胞中分离纯化出来。 ⑤ 有容易被识别筛选的标志。 (一) DNA重组技术中最常用的工具酶 酶类 主要用途 限制性核酸内切酶 识别DNA特定序列，切断DNA链 DNA聚合酶I ? （1）缺口平移制作标记DNA探针；（2）合成cDNA的第二条链；（3）填补双链DNA3’末端；（4）DNA序列分析 反转录酶 （1）合成cDNA；（2）替代DNA聚合酶Ⅰ进行填补，标记或DNA序列分析 末端核苷酸转移酶 在3′羟基末端进行同质多聚物加尾 ? 三、工具酶 DNA连接酶 催化DNA中相邻的5′磷酸基和3′羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接 多聚核苷酸激酶 催化多聚核苷酸5′羟基末端磷酸化，或标记探针 碱性磷酸酶 切除末端磷酸基 基因工程诞生的技术突破 限制性内切酶（restriction enzymes） 1970年H. O. Smith等分离出第一种限制性核酸内切酶。 Werner Arber 理论预见限制酶 Daniel Nathans 用限制酶切得SV40 DNA片断 Hamilton O. Smith 得到第一个限制酶 1978年Nobel生理或医学奖 （二）限制性核酸内切酶** 可以识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA，被称为基因工程的手术刀，广泛使用。已发现多种细菌都含有这类限制——修饰酶体系。 作用 与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。 分类 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ （基因工程技术中常用Ⅱ型） （二）限制性核酸内切酶种类 Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome) 切口 ：平端切口、粘端切口 GGATCC CCTAGG 回文结构：II类限制内切酶要求严格的识别序列和切割位点，大部分II类酶识别DNA中4-8bp具有反转对称的序列。 （二）限制性核酸内切酶作用特点 ① 产生5’突出粘性末端 (cohesive end): 以EcoR I为例： 　 5’…G↓AATT C…3’ → 5’…G??-pTTAAC…3’ 3’…C TTAA↑G…5’ → 3 …CTTAA p -?OH G…5 ② 产生3’突出的粘性末端： 以PstⅠ为例： 5’…CTGCA↓G…3’ → 5’…CTGCAOH-? pG…3’ 3’…G↑ACGTC…5’ → 3’…Gp-? OHACGTC…5 ③ 产生平末端(blunt end): Nru Ⅰ 为例： 5’…GTT↓AAC…3’ → 5’…GTTOH- pAAC…3’ 3’…CAA↑TTG…5’ → 3’…CAAp -OHTTG…5’ 限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)在重组DNA技术中有重要地位 限制性核酸内切酶的种类很多，至今已发现近1800多种，可根据它们对DNA有不同的识别序列和切割特征选用，从而为基因工程提供有力工具。 配伍末端： 识别序列不同，但切割DNA后产生相同类型的粘性末端。 * * * 特异转录因子 为个别基因转录所必需，决定该基因的时间、空间特异性表达。 转录激活因子-通过蛋白质-DNA、蛋白质-蛋白质相互作用起正性转录调节作用的因子