基因操作原理02.pptxVIP

第二章 分子克隆工具酶 ;切割位点可为获得DNA的物理图的特殊的标记 利用限制性内切酶切割产生特殊DNA片段的能力使得纯化那些DNA片段成为可能 获得的限制性DNA片段可作为DNA操作中的基本介质;任何物种都有 排除异物保护自身的防御机制 免疫系统 细菌的限制与修饰系统;第一节 限制性内切酶;一、限制与修饰 Restriction and modification ;1. 现象;E. coli K;E.coli K E.coli B E.coli C ;E.coli K E.coli B E.coli C ;说明K和B菌株中存在一种限制系统 可排除外来的DNA 10-4的存活率是由宿主修饰系统作用的结果 甲基化：A N6甲基-腺膘呤 C 5‘甲基-胞嘧啶 ;2. 限制酶的发现 60年代，限制内切酶和限制酶的概念 1968年 首次从E.coli K中分离限制性内切酶 ;1970年 美国约翰·霍布金斯大学 H.Smith 偶然发现 流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae） 能迅速降解外源的噬菌体DNA 无细胞提取液可降解E.coli DNA 但不能降解自身DNA 即HindII酶;5’ ...G T Py Pu A C... 3’ 3’…C A Pu Py T G... 5’ ;5’ ...G A A T T C... 3’ 3’…C T T A A G... 5’ ;3. 限制酶的命名;早前 加R, or M 菌株号和序号小写;Restriction Enzymes 3529 Type I 49 Type II 3470 Type III 10 Methyl-Directed 4 ;Enzymes: Restriction Enzymes 3601 Type I 51 Type II 3540 Type III 10 Methyl-Directed 4 Weirdo REs 1 Putative REs 631 ;Commercial Availability: Restriction Enzymes: 583 568 Methylases: 18 17 Homing Endonucleases: 6 5 Nicking Enzymes: 7 8 Distinct Type II RE specificities: 207 213;3. 限制与修饰系统的种类 亚单位组成, 识别序列的种类, 是否需要辅助因子 分三类(I, II ,III) 也有分四类，IIs类，即II 亚类 ;(1) type II 93%;R : 一般为同源二聚体, 反向结合 作用在两条链 M: 单体 DNA同时切割, M只作用新链 ;type IIs 占5% 识别位点非对称, 非间断 4-7bp 切割位点可能在20bp范围内。 R: 与 type II 具有相同的辅助因子要求 M: 通常由两个M来完成,各作用一条链;(2) type I 和 typeIII type I (1%) 种类少 如 EcoR EcoB ;R酶和M酶 各作为一个亚基存在于酶分子中 即R基和M亚基， 还有负责识别DNA序列的S亚基 分别由hsdR，hsd M，hsdS基因编码 属于同一操纵子（转录单位） ;EcoK R2M2S EcoB R2M4S2;M-;识别位点 EcoB TGA*(N)8TGCT A* EcoK AAC (N6)GTGC A * 甲基化位点 °可能的甲基化位点 切割位点1000bp以外, 无特异性