基因操作及其医学应用义.pptxVIP

转基因和基因治疗; 转基因和基因治疗 1．概念和研究现状 2．基因治疗的基本类型 3．转基因的基本方法 4. 转基因的表达和调控 5．基因治疗的运用和前景; 基因治疗是以正常基因替代或置换靶细胞染色质基因组中的致病基因从而产生新表型的治疗方法。 转基因技术则是将目的基因导入靶细胞以建立治疗效应的方法和过程。;转基因及基因治疗;基因治疗的基本类型;;转基因的基本方法;1、病毒法(Viral) 1)逆转录病毒(Restrovirus) RNA病毒，结构缺陷 Packaging Cell; ★ 体内直接转基因治疗（in Vivo）;优势： ① 整合率高; ② 对外源DNA影响小; ③ 单拷贝整合，利于表达调控； ④ 安全。;劣势： ① 容量小; ② 只能感染分裂活跃细胞，体外(Exvivo)转基因; ③ Transite expression; ④ R.V.+P.C+P.C 实验室要求高。; 2） 腺病毒(Adenovirus) 腺相关病毒(Adenoassociated virus) DNA病毒 　　 E1和E3基因缺乏　 263细胞系生长;特点： ① 能感染静止细胞，体内(in vivo)转基因 ② 对某些细胞类型特别亲和力，利于局部基因治疗 ③ 包容量大 ④ 尚无Packaging Cell，欠安全 ⑤ 有较强免疫原性，易引起体内免疫反应;2、非病毒法(Nonviral) 1）显微注射法(Microinjection) 2) 基因定位整合技术(Gene targeting) 3) 受体介导(Receptor-mediated methods) 4) 组织内直接注射(Direct injection of DNA) 5) 磷酸钙沉淀法(CaPO4 precipitation);基因定位整合技术（基因打靶 Gene Targeting);基因打靶的必要条件 打靶载体 打靶载体中的必要成分： 载体DNA 目的基因同源片段 筛选标志基因 neu（新霉素）阳性筛选标志基因； HSV-tk阴性筛选标志基因。 胚胎干细胞;基因敲除的基本程序 1、构建打靶载体 A.获得目的基因的同源片段，将此片段克隆到一般的质粒载体中； B.从重组质粒中切除目的基因的大部分同源DNA序列，只留部分序列在线性质粒载体的两端；; C.将neu基因克隆到带有目的基因同源序列的线性质粒中，使之位于残留目的基因同源序列的中间； D.在目的基因同源序列的外侧线性化重组质粒载体，将HSV-tk基因克??到此线性载体中。;2、打靶载体导入ES细胞 3、基因敲除ES细胞注射入胚泡 4、胚泡植入假孕的小鼠子宫中 5、嵌合体的杂交育种; 附 表 外源DNA的整合 ;Table 1. Methods of delivering genes into mammalian cells and likely applications in gene therapy(+).Major application: (+/-), some application; (-). Little or no application; T. only transient expression; S. stable expression ; 1. 启动子(promoter) 选用或设计适当地强启动子能使外源性基因在宿主体内高效表达。 2．内含子(intron) 在转基因过程中，内含子可增强基因表达。; 3．反式作用因子(Trans-activator) 能激活不同种外源基因转录，提高转录基因的表达效率。 4．载体(Vector) 要考虑病毒载体与外源基因之间的相互干扰，必要时切除载体上无关序列，以决定病毒载体与目的基因的最佳组合，使其表达达到最佳效率。; 1、肿瘤的基因治疗 1) 肿瘤的免疫基因治疗 ． ★载体细胞靶向表达细胞因子 载体细胞: 肿瘤浸润淋巴细胞(TILs) 淋巴因子激活的杀伤细胞(LAKs) 细胞因子:IL-1,2,4,6,7, IFNs，TNF-α,CSF。 ★肿瘤疫苗: 改变肿瘤细胞免疫原性，诱导强 烈免疫反应;2)反义技术抑制肿瘤基因功能 人工合成癌基因DNA或RNA(mRNA)