基因测序及分析.pptxVIP

人类基因组;序列测定的技术 ;与 PCR反应类似。 反应体系中包含：模板 DNA, Taq酶, dNTPs, ddNTPs和测序引物； 反应过程： 变性－复性－延伸－终止 ;Dideoxynucleotides（双脱氧核苷酸）;*;Sanger第一步：加入复制终止剂;ddNTPs参与下的DNA复制;Sanger第二步：荧光检测;Gel Electrophoresis DNA Fragment Size Determination;Analyzed Raw Data;Maxam-Gilbert法;碱基特异性化学切割反应： 硫酸二甲酯（DMS ）：使DNA分子中鸟嘌呤（G）上的N7原子甲基化。 肼：使DNA分子中胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C）的嘧啶环断裂；但高盐条件??，只C断裂，而不与T反应。 哌啶：从修饰甲基处断裂核苷酸链。 在不同的酸、碱、高盐和低盐条件下，三种化学试剂按不同组合可以特异地切割核苷酸序列中特定的碱基。 ;G反应：DMS使G在中性和高温条件下脱落。 G+A反应：酸性条件（如甲酸）可使A和G嘌呤环上的N原子质子化，利用哌啶使A、G脱落。 T+C反应：肼（低盐） C反应：肼（高盐） 测定DNA长度~250bp。 ;化学裂解法测定DNA的核苷酸序列;杂交法SBH （Sequencing by hybridization） 用特定长度的具有所有可能碱基序列的寡核苷酸探针与未知序列的DNA片段杂交。根据某些探针形成的完全双链，推知目的DNA的碱基序列。 ;基因组测序;DNA测序不能从染色体进行，首先必须克隆化，构建基因组的物理图谱。 先构建片段DNA克隆(以YAC或BAC为载体)，并把克隆依染色体排序，这就是“染色体的克隆图”。依片段DNA克隆在染色体上所在的位置排序，可以得到相互重叠的一系列克隆，叫做“克隆重叠群”(contig)。选取有关的克隆进行DNA测序，就可以“拼装”出整个染色体或基因组的DNA序列。如果克隆片段太大仍不便于直接测序，则需通过亚克隆，构建更小的片段。 另外一种方法是对所有相互重叠的亚克隆进行测序，然后直接通过计算机程序根据其重叠部分进行“拼装”。;完整基因组的测序过程一般包括三个步骤： （1）建立克隆的物理图谱：如酵母人工染色体YAC（Yeast Artificial Chromosome）克隆、细菌人工染色体BAC（Bacterial Artificial Chromosome）克隆等； （2）利用鸟枪法（Shotgun Strategy）测定每个克隆的序列； （3）序列拼装和注释：当得到一段DNA序列之后，可以利用序列分析工具，进行序列的拼接；继而通过与数据库序列的比较，得到与该序列相关的信息，如基因、调控元件、重复区域等，进而对序列的生物学特性进行注释。 ;鸟枪测序法(shotgun sequencing)  大分子DNA被随机地“敲碎”成许多小片段，收集这些随机小片段并将它们全部连接到合适的测序载体（如M13噬菌体）；小片段测序完成后，根据重叠区计算机将小片段整合出大分子DNA序列。这就是所谓的鸟枪测序法。  ;将DNA大片段切割成小片段的三种方法： 限制性内切酶 超声波处理 DNA酶I降解(加Mn2+) 在这三种方法处理前， DNA的纯化非常重要，要去除载体DNA或仅由载体DNA产生的片段。;;;鸟枪法测序的缺点;引物步移策略 将待测DNA片断克隆在质粒载体上，利用引物步移延伸，从DNA片断的一端开始逐步进行序列测定，直至另一端为止。 克服了鸟枪法的盲目性，并省去亚克隆制备步骤，也减轻了数据分析工作量。 但由于测定下一段序列前要预先知道上游序列的碱基顺序，才能合成适当的引物进行测序。 定向缺失克隆策略、染色体步查法等。;Gel Electrophoresis DNA Fragment Size Determination;Maxam-Gilbert法;化学裂解法测定DNA的核苷酸序列;基因组测序;鸟枪测序法(shotgun sequencing)  大分子DNA被随机地“敲碎”成许多小片段，收集这些随机小片段并将它们全部连接到合适的测序载体（如M13噬菌体）；小片段测序完成后，根据重叠区计算机将小片段整合出大分子DNA序列。这就是所谓的鸟枪测序法。  ;将DNA大片段切割成小片段的三种方法： 限制性内切酶 超声波处理 DNA酶I降解(加Mn2+) 在这三种方法处理前， DNA的纯化非常重要，要去除载体DNA或仅由载体DNA产生的片段。