基因的体外重组和转化.pptxVIP

磷酸二酯键的形成;连接方式： 黏性末端的连接 平头末端的连接 修饰黏性末端的连接 PCR产物的连接 Gateway载体构建体系;一、黏性末端的连接;1.同种酶产生的黏末端的连接;优 点;问 题;;2.不同限制酶酶切产生黏末端的连接 载体和目的基因分子上有两个相同的酶切位点;载体和目的基因只有一个相同的限制酶识别位点;无相同的限制酶识别位点，有同尾酶 SalⅠ片段（CAGCTG） XhoⅠ 片段(GAGCTC) ;若均不是以上情况呢？;二、平末端的连接;平端连接;优 点;5’-突出粘性末端的补齐 可用Klenow聚合酶补齐 3’-突出粘性末端的削平 可用T4 DNA聚合酶削平 ;主 要 问 题;三、修饰黏末端连接;优 点;存在问题;衔接物连接法 衔接物（linker）是指用化学方法合成的一段由8～12个核苷酸组成、具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸短片段。;DNA接头法： DNA接头（adapter）是一类人工合成的一头具某种限制酶粘性末端另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片段。;人工接头连接;讨论 如何将一平末端的DNA片段与BamHⅠ形成的粘性末端连接？（P156.4）;四、PCR产物的连接 1.限制性内切酶酶切位点引入法 在引物上添加或引入限制酶识别位点，使PCR产物两端带有相应的限制酶识别位点，进一步与相应载体进行连接。;（1）在引物上添加酶切位点;！！注意 ①添加保护序列 Primer1: 5?GCGGggatccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGA Primer2: 5‘ GCGGggatccTCTTGTACAGCTCGTCCATGCC ②引入的酶切位点是单一的;（2）利用突变在引物5‘端引入酶切位点 通过在PCR引物序列的5’端突变一个或几个碱基，创造出限制酶识别位点的方法。;2.T-A克隆 利用嗜热聚合酶如Taq聚合酶的模板非依赖性末端转移酶活性(在70～75℃活性高)，使PCR产物的3′末端加一个A的粘性端，将其直接克隆至3′粘性末端含一个T的线性克隆载体中.;Taq 酶 PCR扩增;T载体的构建： 用限制性内切酶如XcmI, HphI, 与MobII 酶切产生3‘末端未配对的T； 应用末端转移酶与双脱氧TTP加入一个突出的T残基到线形化载体的3’末端。 应用不依赖末端的Taq DNA聚合酶的末端转移酶活性在线形化载体的3‘末端出的羟基基团上催化连接上一个T碱基。 ;五、Gateway载体构建系统 Gateway技术： 一种克隆操作平台：把目的基因克隆到入门载体（Entry Vector）后，就不用依赖限制性内切酶，而靠载体上存在的特定重组位点和重组酶，高效、快速地将目的基因克隆到其它的受体载体（Destination Vector，目的载体）上。;Gateway技术的灵活性：;整合后的附着位点为 attL（BOP’） attR（POB’） 整合位点---attB attP 切除位点---attL attR 整合过程需要介导蛋白和重组位点。 ;第二节、重组体导入细菌细胞;重组体的转化;受体细胞的选择;一、大肠杆菌感受态的制备 ; 1970年Mandel和Higa发现用CaCl2处理过的大肠杆菌能够吸收噬菌体DNA。此后不久，Cohen等人用CaCl2法实现了质粒DNA转化大肠杆菌的感受态细胞，操作原理如下：;将处于对数生长期的细菌置入0℃的CaCl2低渗溶液中，使细胞膨胀，再加入DNA，Ca2+与DNA结合形成抗DNase的羟基-磷酸钙复合物，并粘附在细菌细胞膜的外表面上；经短暂的42℃热脉冲处理后，细菌细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，随之出现许多间隙，致使通透性增加，DNA分子便趁机进入细胞内。;CaCl2处理;二、重组DNA导入大肠杆菌; 重组DNA转移到大肠杆菌细胞内的过程 1.吸附：双链DNA分子吸附在受体菌表面 2.转入：双链DNA分子解链，单链DNA分子进入受体菌，另一链降解； 3.自稳：外源质粒DNA分子在细胞内又复制成双链环状； 4.表达：供体基因随同复制子同时复制，并被转录、翻译。;;转化项目 ;转化率：转化细胞/细胞总数 影响因素： 细胞生长状态和密度 质粒的质量和浓度 试剂的质量 杂菌和杂DNA的污染 ;思考题： 试述 DNA片段的体外连接方式？;练习题： 打算将一