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Do more, get more 上海卓灏医药科技有限公司 联系电话：400-821-5712 网址： PAGE2 / NUMPAGES8 高通量测序样品制备 一、样品制备的基本原则 代表性原则：取样的代表性直接关系到实验结果的最后解释和后续分析的的准确性和科学性。实验样品取样，包括样品类型，取样的操作流程，实验分组的设定。基本要求实验处理组和对照组的样品在取材方式和处理条件等方面尽可能保持一致，否则可能会影响实验结果的重复性和可信度。 准确性原则：取样的准确性直接关系到实验结果的科学意义。所有样品取材必须被准确记录，并按要求（低温、迅速）采集、制备、贮存、运输，最终正确地按实验设计进行实验和数据处理，以减少外界因素对样品影响，保证最后的实验结果能够真实的反应样品的状态。 低温原则：所取样本离体后，应立即置于液氮中，并保证在实验前始终处于-70℃以下，以避免RNA的降解。 规范性原则：实验过程包括样品收集、贮存、运输以及后续处理是决定芯片实验结果的稳定性和可信度的关键因素，因此必须制订和严格执行规范化芯片样品的制备规范操作流程。 二、高通量测序Total RNA和DNA用量标准 1、高通量测序DNA用量标准 测序类型 样品类型 质检结果 总量 浓度 电泳图 全基因组测序 基因组DNA m≥6ug c≥30ng/μl 电泳检测无明显RNA条带， 基因组条带清晰、完整 外显子测序 基因组DNA m≥6ug c≥30ng/μl 电泳检测无明显RNA条带， 基因组条带清晰、完整 甲基化测序 基因组DNA m≥10ug c≥50ng/μl 电泳检测无明显RNA条带， 基因组条带清晰、完整 ChIP-Seq Chip样品 m≥20ng - 主峰在100bp-500bp之间 （Agilent 2200检测） 注意事项： 1）总量不足或浓度过低：可能文库构建失败；可能文库产量低不能上机测序或测序数据量不足；可能影响文库随机性、数据覆盖度可能偏低；ChIP样品可能存在adapter污染率偏高。 2）DNA定量： NanoDrop定量结果只会作为参考而不会用于总量计算，因为NanoDrop是基于紫外吸收峰OD值进行定量，包括DNA、RNA、蛋白质、盐离子或其他有机物质等在260nm均有一定吸收值，容易造成读数偏高，NanoDrop或分光光度计等结果可能比Qubit定量高出2-10倍；而Qubit定量是通过特异性结合到双链DNA的荧光染料进行定量，定量结果更为准确，最后定量以Qubit定量结果为准。 3）样品进行检测时最少需要消耗1-2μl样品，建议样品体积大于10μl。 4）DNA样品应尽量避免多糖、蛋白质和外切酶的残留；样品必须注明溶剂成分。 2、高通量测序Total RNA用量标准 测序类型 样品类型 质检结果 总量 浓度 电泳图 RNA-Seq 植物、真菌 Total RNA m≥10ug c≥200ng/μl，RIN≥6.5，28S/18S≥1.0 图谱基线无上抬；5S峰正常；无DNA或杂质污染。 人、鼠 Total RNA m≥6ug c≥80ng/μl，RIN≥7.0，28S/18S≥1.0 图谱基线无上抬；5S峰正常；无DNA或杂质污染。 其他动物 Total RNA m≥10ug c≥200ng/μl，RIN≥7.0，28S/18S≥1.0 图谱基线无上抬；5S峰正常；无DNA或杂质污染。 oligo(dT)纯化的mRNA，去rRNA的RNA m≥0.2ug c≥15ng/μl，rRNA10% 片段主要分布在1K以上 小RNA测序 真核生物Total RNA m≥10ug c≥300ng/μl，RIN≥8.0，28S/18S≥1.5 图谱基线无上抬；5S峰正常；无DNA或杂质污染。 Small RNA（＜200nt） m≥2μg c≥200 ng/μl - 注意事项： 1) RNA总量不足或过低：可能导致文库构建失败、文库产量低不能上机测序；可能导致RNA-Seq数据duplication比例高，随机性差。 2) 降解样品：可能导致建库失败；可能导致RNA-Seq数据duplication比例高，随机性差；可能导致Small RNA rRNA污染比例高，影响有效数据。 3) Small RNA含量低：部分样品total RNA达到要求，但是由于样品特异性，small RNA含量远远低于正常样品（如培养细胞等），可能导致建库失败。 4) Small RNA（200nt）样品：无法判断RNA的完整性，对样品中降解的rRNA/tRNA比例无法预估，文库中可能rRNA/tRNA污染比例高，严