普通植物病理学 实验4 细菌及其所致病害-植物保护.pdfVIP

实验四细菌病原及其所致病害 中国农业大学植物病理学系 刘倩 （liuqian@cau.edu.cn ） 实验目的： 了解细菌病原及其所致病害特点； 学习病原细菌分离纯化技术； 学习植物病原细菌的接种方法，了解植物病原细 菌的侵入方式； 证明细菌的致病性（柯赫氏法则）。 柯赫氏法则 确认分离自发病动植物上的微生物是否为引起病害的病原 物有4条标准或规则，称为“柯赫氏法则”： 1. 在每个被检查的罹病生物（植物）上必须存在疑似病原 物（细菌或其他微生物）； 2. 这种疑似病原物（细菌或其他微生物）必须能从寄主 （植物）上分离得到，并能被纯培养； 3. 把纯培养的疑似病原物接种到健康感病寄主（植物） 上，寄主必须再现特定病害； 4. 在接种和发病的寄主上必须能重新得到相同的病原物， 即重新得到的病原物必须具有第2步中生物相同的特征。 实验内容 大白菜 软腐病菌的分离：系列稀释法； 大白菜 软腐病菌的接种：伤口接种； 实验材料和用具 植物病原细菌：胡萝卜软腐欧文氏菌 （Erwinia carotovora ） 植物材料：大白菜； 牛肉膏蛋白胨培养基； 70%乙醇溶液； 灭菌水、移液器、震荡器、接种针、镊子、剪 刀、玻棒、涂布器、灭菌塑料离心管、无菌脱 脂棉、试管架、记号笔、吸水纸、酒精灯、打 火机等 细菌分离纯化的方法： 平板划线法； 系列稀释法； 大白菜软腐病菌的分离 选取新鲜发病的大白菜叶片，并以健康叶片作为对 照； 对待分离部位进行表面消毒（70 ％乙醇），再用无菌 水冲洗3遍，晾干； 用灭菌刀片切取0.5 ×0.5 cm病健交界处植物组织，置 于灭菌离心管中； 加入0.5mL灭菌水，用玻璃棒充分碾碎，静置一会； 震荡，系列稀释4次； 取第2，3，4次稀释液各50 μL，均匀涂板； 菌液被培养基吸收后，反转放置，28℃培养。 胡萝卜软腐欧文氏菌的接种 挑取培养好的细菌单菌落置于灭菌试管中，加 入少量灭菌生理盐水，将试管置于震荡器上震 荡使细菌充分悬浮，利用浊度计或分光光度计 确定细菌悬液浓度（106 8 -10 cells/mL）； 对待接种部位进行表面消毒（70 ％乙醇），再 用无菌水冲洗3遍，晾干； 用无菌的接种针在大白菜叶片中部刺伤（扎孔 3个）；用移液器滴加细菌悬液5-10微升，接 种在大白菜刺伤处；等量灭菌水接种作为对照。 接种后植物材料置于消毒容器中，25-28 C下 保湿培养24-48 h观察并记录结果。 注意事项 无菌操作：火焰、酒精 顺序：分离、稀释、刺伤、接种等 对照实验 分组 4人/组 一个超净台/组； 6个牛肉膏蛋白胨培养皿/组（发病组织和健 康对照各3皿）； 接种用大白菜叶片4片/组（接菌和无菌水各 2片）。 作业： 撰写实验报告 详细记录病原细菌分离和接种方法； 纯化所得单菌落数量、种类和菌落特征； 计算所分离植物材料中的活菌数（CFU ）； CFU：colony forming unit 记录接种试验各处理的白菜叶片上的病斑大 小； 试验中出现问题的分析。 两天后观察记录试验的结果，下周实验课上交实验报告。