细胞工程论文植物细胞培养生产和提纯花青素的初步研究.docxVIP

植物细胞培养生产和提纯花青素的初步研究 摘 要：花青素，是自然界一类广泛存在于植物中的有着防癌、抗氧化等功效的水溶性天然色素，本文对国内外关于花青素的植物来源、合成机理、生物活性等进行了概括，着重对利用植物细胞培养技术生产花青素, 通过外植体的选择、高产细胞系的选择培养条件优化、培养技术的选择、前体物的添加、诱导提高花青素的产量以及探究高效的提纯方法进行初步探究。 关键字：花青素 植物细胞培养 提高产量 分离提纯 Abstract： Key words： 花青素的概况 花青素(Anthocyanidin)，又称花色素，是自然界一类广泛存在于植物中的水溶性天然色素，属类黄酮化合物。是一种次生代谢物，也是植物花瓣中的主要呈色物质 [1]。花青素存在于植物细胞的液泡中，可由叶绿素转化而来。受许多因子的影响，低温、缺氧和缺磷等不良环境也会促进花青素的形成和积累 [2]。 花青素类色素广泛存在于所有深红色、紫色或蓝色的蔬菜水果，比如钙果、葡萄、黑莓、无花果、樱桃、甜菜根、茄子、紫甘薯、黑龙珠土豆、血橙、红球甘蓝、蓝莓、红莓、草莓、桑葚、山楂皮、紫苏、黑(红)米、牵牛花等植物的组织中。自然界有超过 300 种不同的花青素。其中蓝莓所含花青素量最大最多最有营养价值。 1.1 花青素的理化性质 花青素的基本结构单元是 2 一苯基苯并吡喃型阳离子，即花色基元。 花青素分子中存在高度分子共轭体系，具酸性与碱性基团，易溶于水、甲醇、乙醇、稀碱与稀酸等极性溶剂中。不溶于乙醚、氯仿等有机溶剂，遇醋酸铅试剂会沉淀，并能被活性炭吸附。在紫外与可见光区域均具较强吸收，紫外区最大吸收波长在 280nm 附近，可见光区域最大吸收波长在 500～550nm 范围内。花青素类物质的颜色随 pH 值的变化而变化，Ph7 呈红色，pH 在 7-8 时呈紫色， pH11 时呈蓝色[2] 花青素是糖苷衍生物，其基本结构如下[3]： 花青素核结构有双键存在，能图吸1.花收青可素见结光构而呈一定的颜色。花青素在波长范围分别为 465~560nm 和 270～280nm 有最大光吸收。糖基有时与丙二酸、苹 果酸、琥珀酸和乙酸等脂肪酸或 p-香豆酸、咖啡酸、芥子酸、对羟基苯甲酸、阿魏酸等芳香酸酰基化形成酰化花青素[4]。 1.2 花青素的制备 花青素主要以糖苷的形式存在于表皮细胞的液泡内，是花和果实中的主要色素。花青素是植物中广泛存在的次生代谢产物。花青素的制备方法包括化学合成法、生物合成法和植物提取法。 1.2.1 化学合成法 花青素的化学合成方法先通过立体选择性还原方法合成原花青素，再通过原花青素的进一步反应合成花青素。原花青素是植物中广泛存在的一大类多酚类化合物的总称。原花青素在植物界中广泛存在，人们对它的 研究已有几十年的历史。1697 年，美国 Joslyn 等从葡萄皮和葡萄籽中提取分离出 4 种多酚类化合物，这些化合物在酸性介质中加热均可产生花青素（Cyanidins）故将这些化合物命名为原花青素。其反应过程如图 2 所示。 但是化学合成的副产物相对来说比较多，别是产特物的异构体难以分离 ， 造成产物的纯度不高 ，在一定程度上带有一定的毒性， 因而影响了其应用于食品 、药品等安全性要求极高的领域[5] [6] 。 图 2 花青素异构物 1.2.2 生物合成法 20 世纪 80 年代末 90 年代初，植物花青素及类黄酮物质代谢途径研究已 较为成熟。花青素是植物中广泛存在的次生代谢产物，是通过两条途径合成的。 环和 C3 桥是由莽草酸途径合成的，A 环是丙二酸途径合成的[4]。（图 3） 图 3 生物合成法 苯丙氨酸是花青素及其他类黄酮生物合成的直接前体，由苯丙氨酸到花青素经历 3 个阶段：第 1 阶段由苯丙氨酸到香豆酰 CoA，这是许多次生代谢共有的，该步受苯丙氨酸解氨酶（PAL）基因活性调控。PLA 是多酚类物质代谢途径中的一个限速酶，分子量在 220~330KDa，其全酶由四个相同亚基组成四聚体，最适 pH 在 8~9.5 之间。PLA 的活性部位具有脱氢丙氨酰基的亲电中心。在组织中的活性可随外界因素而发生显著变化，用光照，病伤害，植物激素处理等会使活性显著增加。另外有时还受光敏色素所支配。第 2 阶段由香豆酰 CoA 和丙二酰 CoA 到二氢黄酮醇，是类黄酮代谢的关键反应，该阶段产生的黄烷酮和二氢黄酮醇在不同酶作用下，可转化为花青素和其他类黄酮物质。该步骤受查尔酮合成酶和黄烷酮-3-烃化酶的活性调控。第 3 阶段是各种花青素的合成[2]。过程如下图 4 生物合成图 1.2.3 花青素生物合成代谢途径的分子调控 多数的花青素途径调控发生在结构基因的转录水平上，受多中转录因子在不同时空上的组合调控，还有一些受转录后水平的调控。在花青素转录过程中 WD40，WRKY,B