牛源大肠埃希菌HPI毒力岛irp1基因敲除及对其毒力和生物学特性影响.pdf

摘 要 摘 要 奶牛子宫内膜炎是目前世界各国奶牛养殖和生产中最为常见且造成损失最大的疾 病之一，在我国65％至80％奶牛不孕是子宫内膜炎所导致的。引起奶牛子宫内膜炎的 主要病原微生物包括细菌、支原体、钩端螺旋体、病毒、真菌及毛滴虫等，细菌中主要 是大肠埃希菌、变形杆菌、链球菌和金黄色葡萄球菌等。 为了确定大肠埃希菌致病能力与HPI 毒力岛irp1基因的关系，本试验使用自杀性质 粒pRE112 构建了大肠埃希菌irp1基因缺失株和回补株，进行了irp1基因的功能验证， 获得如下结果： 1. 对 14 株大肠埃希菌 （编号E1-E14）进行氯霉素抗性和irp1基因的检测，菌株 E1、E4、E6、E8、E9 和E12 对氯霉素敏感且irp1基因阳性，选取菌株E4 进行irp1基 因敲除和回补。 2. 使用重叠PCR 法，以E4 基因组为模板，融合irp1上下游同源臂，克隆融合片 段到自杀性质粒pRE112，成功构建重组自杀性质粒pREΔirp1。以含重组自杀性质粒 pREΔirp1 X7213 E4 的大肠埃希菌 为供体菌，大肠埃希菌 为受体菌进行共培养，通过两 步同源重组筛选出缺失株E4Δirp1。最后同样使用自杀性质粒pRE112 得到回补株 E4Δirp1-C。 3. 对亲本株、缺失株和回补株进行相关生物学特性的研究，结果表明大肠埃希菌 irp1基因缺失会导致：（1）大肠埃希菌对小鼠的LD 降低10倍； （2）除基因hlyA 和 50 csgB 以外，基因ecpA，fimA，kpsD，faeG，clbD，stfG，sfmH，ipfA 和fimH 表达量不 3 OD 29.8% 同程度的减少； （）结晶紫染色法测定生物膜形成能力时，其 600 值下降了 。 基因回补后功能恢复。此外，亲本株、缺失株和回补株的生化特性、药物敏感性、生长 规律和铁载体形成能力没有变化。说明irp1基因与大肠埃希菌致病能力密切相关，irp1 基因的缺失或者表达抑制会降低大肠埃希菌毒力，而对其生化特性、药物敏感性、生长 规律和铁载体形成能力没有影响。 关键词：奶牛子宫内膜炎；大肠埃希菌；基因敲除；毒力岛 I 目 录 目 录 摘 要I ABSTRACTII 第一章 文献综述1 1.1 大肠埃希菌毒力岛的研究1 1.1.1 高致病性毒力岛的研究2 1.1.2 其他毒力岛的研究5 1.2 大肠埃希菌生物膜研究5 1.3 大肠埃希菌其他毒力因子研究6 1.3.1 黏附素6 1.3.2 肠毒素6 1.3.3 鞭毛7 1.3.4 α-溶血素 （HlyA）7 1.4 研究的目的和意义7 第二章 大肠埃希菌缺失株E4Δirp1和回补株E4Δirp1-C 的构建和鉴定8 2.1 材料8 2.1.1 菌株与质粒8 2.1.2 主要试剂及仪器9 2.1.3 主要培养基和试剂10 2.1.4 引物10 2.2 方法11 2.2.1 基因敲除菌株的筛选11 2.2.2 备选菌株基因组的提取11 2.2.3PCR 产物和酶切